Каким образом методами генной инженерии получают инсулин в промышленных масштабах?

9 ответов на вопрос “Каким образом методами генной инженерии получают инсулин в промышленных масштабах?”

  1. Gladi2001 Ответить

    2.2. Методы генной инженерии 11
    2.3. Получение инсулина методами генной инженерии 14
    Заключение 18
    Литература 20
    Приложение 22
    Содержание

    Выдержка из текста

    При этом в составе гибридного белка оба эти компонента могут присутствовать одновременно. Кроме этого, при создании гибридных белков может использоваться принцип мультимерности — присутствия нескольких копий целевого полипептида в гибридном белке, что позволяет существенно повысить выход целевого продукта.
    В Великобритании синтезированы обе цепи человеческого инсулина с помощью E. coli, соединенные в молекулу биологически активного гормона. Чтобы одноклеточный организм мог синтезировать на своих рибосомах молекулы инсулина, необходимо снабдить его нужной программой, то есть ввести ему ген гормона.
    В Институте РАН с использованием генно-инженерных штаммов E. coli получен рекомбинантный инсулин. Из выращенной биомассы выделяется гибридный белок-предшественник, экспрессируемый в количестве
    40. от всего клеточного белка, содержащий препроинсулин.
    Превращение его в инсулин in vitro осуществляется в той же последовательности, что и in vivо — отщепляется лидирующий полипептид, препроинсулин превращается в инсулин через стадии окислительного сульфитолиза с последующим восстановительным замыканием трех дисульфидных связей и ферментативным вычленением связывающего С-пептида. После ряда включающих ионообменные, гелевые и ВЭЖХ хромотографических очисток получают человеческий инсулин высокой чистоты и природной активности.
    Для получения инсулина используют штамм со встроенной в плазмиду нуклеотидной последовательностью, экспрессирующей гибридный белок, состоящий из линейного проинсулина и фрагмента белка, А Staphylococcus aureus, присоединенного к его N-концу через остаток метионина [8, 9, 10].
    Культивирование насыщенной биомассы клеток рекомбинантного штамма обеспечивает начало производства гибридного белка, выделение и последовательная трансформация которого in tube приводят к инсулину.
    Возможен и другой путь: получение в бактериальной системе экспрессии рекомбинантного белка, состоящего из проинсулина человека и присоединенного к нему через остаток метионина полигистидинового «хвоста». Его выделяют с использованием хелатной хроматографии на колонках с Ni-агарозой и расщеплением бромцианом.
    Выделенный белок является S-сульфонированным. Картирование и масс-спектрометрический анализ полученного проинсулина, очищенного ионнообменной хроматографией на анионите и ОФ (обращеннофазовой) высокоэффективной жидкостной хроматографией, показывают наличие дисульфидных мостиков, которые соответствуют дисульфидным мостикам нативного проинсулина человека.
    В последнее время пристальное внимание уделяется упрощению процедуры получения рекомбинантного инсулина методами генной инженерии. Так, например, можно получать белок, состоящий из присоединенного к N-концу проинсулина через остаток лизина лидерного пептида интерлейкина
    2. Белок эффективно экспрессируется и локализуется в тельцах включения. После выделения белок с получением инсулина и С-пептида расщепляется трипсином [5, 8, 10].
    Полученные инсулин и С-пептид очищаются ОФ ВЭЖХ. Весьма существенным при создании слитых конструкций является соотношение масс белка носителя и целевого полипептида.
    С-пептиды с помощью аминокислотных спейсеров, несущих сайт рестрикции Sfi I и два остатка аргинина в начале и в конце спейсера для последующего расщепления белка трипсином, соединяются по принципу «голова-хвост».
    ВЭЖХ продуктов расщепления показывает, что отщепление С-пептида проходит количественно, а это позволяет использовать способ мультимерных синтетических генов для получения целевых полипептидов в промышленном масштабе.

    Заключение

    Радикальным, а в большинстве случаев единственным средством для поддержания жизни и трудоспособности больных сахарным диабетом до настоящего времени служит инсулин.
    До получения и внедрения инсулина в клиническую практику в течение одного-двух лет с начала заболевания больных сахарным диабетом I типа ждал летальный исход, несмотря на применение самых изнурительных диет.
    Больные сахарным диабетом I типа нуждаются в пожизненной заместительной терапии препаратами инсулина. Прекращение регулярного введения инсулина в силу тех или иных причин ведет к быстрому развитию осложнений и скорой гибели больного.
    В настоящее время по распространенности сахарный диабет находится на III месте после заболеваний сердечно-сосудистой системы и злокачественных опухолей. Распространенность сахарного диабета среди взрослого населения, по данным Всемирной организации здравоохранения, в большинстве регионов мира составляет 2−5% и имеет тенденцию к увеличению каждые
    1. лет количества больных почти в два раза. Численность инсулинзависимых больных, несмотря на очевидный прогресс в области здравоохранения, увеличивается с каждым годом и на текущий момент только в России составляет около 2 миллионов человек.
    Наиболее перспективными методами получения инсулина являются методы генной инженерии. Генно-инженерный инсулин получают раздельным получением цепей, А и В с использованием разных штаммов-продуцентов и последующим фолдингом молекулы, с последующим разделением изоформ, и синтез в клетках E. Coli проинсулина с его расщеплением трипсином и карбоксипептидазой и получением нативный инсулина.
    Создание препаратов отечественного генно-инженерного инсулина человека открывает новые возможности решения многих проблем диабетологии России для спасения жизни миллионов людей, страдающих сахарным диабетом.

    Литература

    Балаболкин М.И., Клебанова Е.М., Креминская В.М. Сахарный диабет: современные аспекты диагностики и лечения/ Доктор; под ред. Г. Л. Вышковского.-2005.- М.: РЛС-2005, 2004.- 960 с.
    Гавриков, А.В. Оптимизация биотехнологического производства субстанций рекомбинантных интерферонов человека: дис. … канд. биол. наук — М, 2003 г.
    Генно-инженерный инсулин человека. Повышение эффективности хроматографического разделения при использовании принципа бифункциональности. / Романчиков А.Б., Якимов С.А., Клюшниченко В.Е., Арутунян А.М., Вульфсон А.Н. // Биоограническая Химия, 1997 — 23, № 2
    Глик Б., Пастернак Дж. Контроль применения биотехнологических методов// Б. Глик, Дж. Пастернак / Молекулярная биотехнология = Molecular Biotechnology. — М.: Мир, 2002. — С. 517−532. — 589 с.
    Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. М.: Мир, 2002.
    Девис Р., Ботстайн Д, Рот Дж. Методы генетической инженерии. Генетика бактерий // Р. Девис, Д. Ботстайн, Дж. Рот / Пер. с англ.-М.: Мир.- 1984.- 176 с.
    Ермишин А.П. Генетически модифицированные организмы: мифы и реальность / А.П.Ермишин// Мн.: Тэхналогйя.- 2004. — 118 с.
    Основы фармацевтической биотехнологии: Учебное пособие / Т.П. Прищеп, В.С. Чучалин, К.Л. Зайков, Л.К. Михалева. — Ростов-на-Дону.: Феникс; Томск: Издательство НТЛ, 2006.
    Патрушев Л. И. Искусственные генетические системы. // Л. И. Патрушев/ М.: Наука.- 2004.
    Романчиков, А.Б. Генно-инженерный инсулин человека. Повышение эффективности хроматографического разделения при использовании принципа бифункциональности. / А.Б. Романчиков [и др.]

    // Биоограническая Химия. 1997. № 2. с. 23

    Рыбчин В. Н. Основы генетической инженерии// В. Н. Рыбчин / 2-е изд, перераб. и доп.: Учебник для вузов. СПб.: Изд-во СПбГТУ. — 2002. — 522 с.
    Щелкунов С. Н. Генетическая инженерия // Щелкунов С. Н. /Новосибирск: Сиб. унив. изд-во.-2008.
    Щелкунов, С.Н. Генетическая инженерия: учеб-справ. пособие. — 2-е, изд., испр. и доп. — Новосибирск: Сиб. унив. изд-во, 2004. — 496 с.
    http://www.biotechnolog.ru/ge/ge 31.htm
    http://microbiologu.ru
    http://www.mikrobiki.ru
    http://www.gmo-compass.org
    Приложение
    Рис.
    1. Схема расположения дисульфидных связей в молекуле инсулина.
    Рис.
    2. Схема расположения аминокислотных остатков в молекуле инсулина
    Влияние инсулина на ключевые ферменты метаболизма
    Печень Мышцы Жировая ткань Активация 1. Фосфодиэстераза 1. Фосфодиэстераза 1. ЛП-липаза
    2. Фосфофруктокиназа
    2. Фосфофруктокиназа
    2. Фосфофруктокиназа
    3. Пируваткиназа
    3. Пируваткиназа
    3. Пируваткиназа
    4. Пируватдегидрогеназный комплекс
    4. Пируватдегидрогеназный комплекс
    4. Ацетил-КоА-карбоксилаза
    5. Фосфатаза гликогенсинтазы и гликогенфосфорилазы
    5. Фосфатаза гликогенсинтазы б. Ацетил-КоА-карбоксилаза Индукция 1. Глюкокиназа 1. Глицеральдегидфосфат-дегидрогеназа
    2. Цитратлиаза
    2. Пальмитатсинтаза
    3. Пальмитатсинтаза
    4. Пируваткиназа
    5. Ацетил-КоА-карбоксилаза
    6. Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа Репрессия Фосфоенолпируваткарбоксикиназа
    Рис. 3 Схема биосинтеза инсулина в β-клетках островков Лангерганса. ЭР — эндоплазматический ретикулум. 1 — образование сигнального пептида; 2 — синтез препроинсулина; 3 — отщепление сигнального пептида; 4 — транспорт проинсулина в аппарат Гольджи; 5 — превращение проинсулина в инсулин и С-пептид и включение инсулина и С-пептида в секреторные гранулы; 6 — секреция инсулина и С-пептида.
    Рис.
    4. Общая схема синтеза инсулина из его предшественников
    Рис. 5 Синтез инсулина с помощью образования двух раздельных цепей
    18

    Литература

    1. Балаболкин М.И., Клебанова Е.М., Креминская В.М. Сахарный диабет: современные аспекты диагностики и лечения/ Доктор; под ред. Г. Л. Вышковского.-2005.- М.: РЛС-2005, 2004.- 960 с.
    2. Гавриков, А.В. Оптимизация биотехнологического производства субстанций рекомбинантных интерферонов человека: дис. … канд. биол. наук — М, 2003 г.
    3. Генно-инженерный инсулин человека. Повышение эффективности хроматографического разделения при использовании принципа бифункциональности. / Романчиков А.Б., Якимов С.А., Клюшниченко В.Е., Арутунян А.М., Вульфсон А.Н. // Биоограническая Химия, 1997 — 23, № 2
    4. Глик Б., Пастернак Дж. Контроль применения биотехнологических методов// Б. Глик, Дж. Пастернак / Молекулярная биотехнология = Molecular Biotechnology. — М.: Мир, 2002. — С. 517−532. — 589 с.
    5. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. М.: Мир, 2002.
    6. Девис Р., Ботстайн Д, Рот Дж. Методы генетической инженерии. Генетика бактерий // Р. Девис, Д. Ботстайн, Дж. Рот / Пер. с англ.-М.: Мир.- 1984.- 176 с.
    7. Ермишин А.П. Генетически модифицированные организмы: мифы и реальность / А.П.Ермишин// Мн.: Тэхналогйя.- 2004. — 118 с.
    8. Основы фармацевтической биотехнологии: Учебное пособие / Т.П. Прищеп, В.С. Чучалин, К.Л. Зайков, Л.К. Михалева. — Ростов-на-Дону.: Феникс; Томск: Издательство НТЛ, 2006.
    9. Патрушев Л. И. Искусственные генетические системы. // Л. И. Патрушев/ М.: Наука.- 2004.
    10. Романчиков, А.Б. Генно-инженерный инсулин человека. Повышение эффективности хроматографического разделения при использовании принципа бифункциональности. / А.Б. Романчиков [и др.]
    // Биоограническая Химия. 1997. № 2. с. 23
    11. Рыбчин В. Н. Основы генетической инженерии// В. Н. Рыбчин / 2-е изд, перераб. и доп.: Учебник для вузов. СПб.: Изд-во СПбГТУ. — 2002. — 522 с.
    12. Щелкунов С. Н. Генетическая инженерия // Щелкунов С. Н. /Новосибирск: Сиб. унив. изд-во.-2008.
    13. Щелкунов, С.Н. Генетическая инженерия: учеб-справ. пособие. — 2-е, изд., испр. и доп. — Новосибирск: Сиб. унив. изд-во, 2004. — 496 с.
    14. http://www.biotechnolog.ru/ge/ge 31.htm
    15. microbiologu.ru
    16. http://www.mikrobiki.ru
    17. www. gmo-compass.org
    список литературы
    Источник: https://referatbooks.ru/kursovaya-rabota/poluchenie-insulina-metodami-gennoj-inzhenerii/

    способ получения генно-инженерного инсулина человека


    Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению генно-инженерного инсулина человека для изготовления лекарственных препаратов, применяемых при лечении сахарного диабета.
    Способ осуществляют путем культивирования штамма-продуцента гибридного белка, содержащего проинсулин человека, Escherichia coli BL21/pPINS07(BL07) или Escherichia coli JM109/pPINS07, разрушения клеток дезинтеграцией, отделения телец включения, содержащих гибридный белок.
    Далее проводят предварительную отмывку телец включения, одновременное растворение белка и восстановление дисульфидных связей в буфере с 5-10 мМ дитиотреитола и 1 мМ ЭДТА, ренатурацию и очистку ренатурированного гибридного белка ионообменной хроматографией.
    Расщепление гибридного белка проводят совместным гидролизом трипсином и карбоксипептидазой Б при массовом соотношении гибридного белка, трипсина и карбоксипептидазы Б 4000:0,6:0,9.
    Очистку инсулина проводят гидрофобной хроматографией или обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографией с последующей гель-фильтрацией, а выделение инсулина — кристаллизацией в присутствии солей цинка. Изобретение позволяет сократить процесс получения генно-инженерного инсулина человека и увеличить его выход.

    Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению генно-инженерного инсулина человека для изготовления лекарственных препаратов, применяемых при лечении сахарного диабета.
    С учетом основных достижений современной диабетологии и рекомендаций Всемирной организации здравоохранения европейские страны к 2001 году завершили переход на использование человеческих инсулинов. В связи с этим разработка способов получения инсулина с использованием методов ДНК-рекомбинантной технологии является актуальной задачей.

  2. mbhusty Ответить

    Работа с ГТЧ, а также комплексные исследования выделяемых гормонов и их различных форм дают возможность изучать созданные природой системы и лучше их понять. Существование различных нативных форм СТГч в организме свидетельствует об их целесообразности и о возможном применении, например, в клинике.
    При создании новых препаратов СТГч необходимо в первую очередь ориентироваться на нативные природные формы гормона и в случае целесообразности масштабировать их методом генной инженерии, как это делается с мономером СТГч.
    При производстве препаратов СТГч из ГТЧ успешно реализуется комплексная промышленная технология получения и других гормонов аденогипофиза (ЛГч, ФСГч, ТТГч и др.). Необходимо оптимизировать производство, внедряя новые прогрессивные методы (аффинную хроматографию и др.
    ); получать особочистые гормоны по комплексной технологии.
    Надо расширить производство и применение наборов иммуномикроанализа гормонов аденогипофиза для диагностики и биотехнологии, осуществить регламентированное производство стандартизированных антител различной гаммы, создавать новые препараты СТГч, в том числе иммобилизованные.[2] Тот факт, что СТГ влияет на белковый, жировой, минеральный обмен, действует на уровне клетки, не имея органа-мишени, и является анаболиком, дает большие перспективы его применения для стимуляции репарационных процессов и лечения различных заболеваний. Более широкое изучение этих вопросов, как и возможности применения различных модифицированных форм и вариантов СТГч, — актуальная и перспективная задача.[2] Получение инсулина в биотехнологии
    Инсулин, пептидный гормон островков Лангерганса подже­лудочной железы, представляет основное средство лечения при сахарном диабете. Эта болезнь вызвана дефицитом инсулина и проявляется повышением уровня глюкозы в крови. До недавнего времени инсулин получали из поджелудочной железы быка и свиньи.
    Препарат отличался от человеческого инсулина 1—3 аминокислотными заменами, так что возникала угроза аллерги­ческих реакций, особенно у детей. Широкомасштабное терапев­тическое применение инсулина сдерживалось его высокой стои­мостью и ограниченностью ресурсов.
    Путем химической модифи­кации инсулин из животных удалось сделать неотличимым от человеческого, но это означало дополнительное удорожание продукта.[8] Компания EliLilly с 1982 г. производит генноинженерный инсулин на основе раздельного синтеза Е. coliе А- и В-цепей. Стоимость продукта значительно снизилась, получаемый инсулин идентичен человеческому. С 1980 г. в печати имеются сообщения о клонировании гена проинсулина — предшественника гормона, переходящего в зрелую форму при ограниченном протеолизе.
    К лечению диабета приложена также технология инкапсулирования: клетки поджелудочной железы в капсуле, введенные однократно в организм больного, продуцируют инсулин в течение года.
    Компания Integrated Genetics приступила к выпуску фолли-кулостимулирующего и лютенизирующего гормонов. Эти пептиды составлены из двух субъединиц. На повестке дня вопрос о про­мышленном синтезе олигопептидных гормонов нервной систе­мы — энкефалинов, построенных из 5 аминокислотных остатков, и эндорфинов, аналогов морфина.
    При рациональном примене­нии эти пептиды снимают болевые ощущения, создают хорошее настроение, повышают работоспособность, концентрируют внима­ние, улучшают память, приводят в порядок режим сна и бодр­ствования.
    Примером успешного применения методов генетиче­ской инженерии может служить синтез р-эндорфина по техноло­гии гибридных белков, описанной выше для другого пептидного гормона, соматостатина.[7] Способы получения инсулина человека:
    Исторически первым способом получения инсулина для терапевтических целей является выделение аналогов этого гормона из природных источников (островков поджелудочной железы крупного рогатого скота и свиней).
    В 20-х годах прошлого века было установлено, что бычий и свиной инсулины (которые являются наиболее близкими к инсулину человека по своему строению и аминокислотной последовательности) проявляют в организме человека активность, сравнимую с инсулином человека. После этого долгое время для лечения пациентов, страдающих сахарным диабетом I типа, применяли инсулины быка или свиньи.
    Однако через некоторое время было показано, что в ряде случаев в организме человека начинают накапливаться антитела к бычьему и свиному инсулинам, тем самым сводя на нет их действие.
    С другой стороны, одним из преимуществ этого метода получения инсулина является доступность исходного сырья (бычий и свиной инсулин можно легко получать в больших количествах), что и сыграло решающую роль при разработке первого способа получения инсулина человека. Этот метод получил название полусинтетического. [9] При этом способе получения инсулина человека в качестве исходного сырья использовали свиной инсулин. От очищенного свиного инсулина отщепляли С-концевой октапептид В-цепи, после чего синтезировали С-концевой октапептид человеческого инсулина.
    Затем его химически присоединяли, снимали защитные группы и очищали полученный инсулин. При тестировании данного метода получения инсулина было показана полная идентичность полученного гормона инсулину человека.
    Основной недостаток данного способа заключается в высокой стоимости получающегося инсулина (даже сейчас химический синтез октапептида — дорогое удовольствие, тем более в промышленном масштабе).
    В настоящее время инсулин человека, в основном, получают двумя способами:модификацией свиного инсулина синтетико-ферментативным методом и генно-инженерным способом .
    В первом случае метод основан на том, что свиной инсулин отличается от инсулина человека одной заменой на С-конце В-цепи Ala30Thr.
    Замену аланина на треонин осуществляют путем катализируемого ферментом отщепления аланина и присоединение вместо него защищенного по карбоксильной группе остатка треонина, присутствующего в реакционной смеси в большом избытке. После отщепления защитной О-трет-бутильной группы получают инсулин человека.
    Инсулин оказался первым белком, полученным для коммерческих целей с использованием технологии рекомбинантной ДНК. Существует два основных подхода для получения генно-инженерного инсулина человека.
    В первом случае осуществляют раздельное (разные штаммы-продуценты) получение обеих цепей с последующим фолдингом молекулы (образование дисульфидных мостиков) и разделением изоформ.
    Во втором — получение в виде предшественника (проинсулина) с последующим ферментативным расщеплением трипсином и карбоксипептидазой В до активной формы гормона.
    Наиболее предпочтительным в настоящее время является получение инсулина в виде предшественника, обеспечивающее правильность замыкания дисульфидных мостиков (в случае раздельного получения цепей проводят последовательные циклы денатурации, разделения изоформ и ренатурации). [9] При обоих подходах возможно как индивидуальное получение исходных компонентов (А- и В-цепи или проинсулин), так и в составе гибридных белков. Помимо А- и В-цепи или проинсулина, в составе гибридных белков могут присутствовать:
    1) белок носитель — обеспечивающий транспортировку гибридного белка в периплазматическое пространство клетки или культуральную среду;
    2) аффинный компонент — существенно облегчающий выделение гибридного белка.
    При этом оба эти компонента могут одновременно присутствовать в составе гибридного белка. Кроме этого, при создании гибридных белков может использоваться принцип мультимерности, (то есть, в гибридном белке присутствует несколько копий целевого полипептида), позволяющий существенно повысить выход целевого продукта. [10] Экспрессия проинсулина в клетках Е.coli..
    В работе использовали штамм JM 109 N1864 со встроенной в плазмиду нуклеотидной последовательностью, экспрессирующей гибридный белок, который состоит из линейного проинсулина и присоединенного к его N-концу через остаток метионина фрагмента белка А Staphylococcus aureus.
    Культивирование насыщенной биомассы клеток рекомбинантного штамма обеспечивает начало производства гибридного белка, выделение и последовательная трансформация которого in tube приводят к инсулину.
    Другая группа исследователей получала в бактериальной системе экспрессии слитой рекомбинантный белок, состоящий из проинсулина человека и присоединенного к нему через остаток метионина полигистидинового «хвоста». Его выделяли, используя хелатную хроматографию на колонках с Ni-агарозой из телец включения и расщепляли бромцианом.
    Авторы определили, что выделенный белок является S-сульфонированным.
    Картирование и масс-спектрометрический анализ полученного проинсулина, очищенного ионнообменной хроматографией на анионите и ОФ (обращеннофазовой) ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографией), показали наличие дисульфидных мостиков, соответствующих дисульфидным мостикам нативного проинсулина человека. Также сообщается о разработке нового, усовершенствованного способа получения инсулина человека методами генной инженерии в прокариотических клетках. Авторами установлено, что полученный инсулин по своему строению и биологической активности идентичен гормону, выделенному из поджелудочной железы. [13] В последнее время пристальное внимание уделяется упрощению процедуры получения рекомбинантного инсулина методами генной инженерии. Так получили слитой белок, состоящий из лидерного пептида интерлейкина присоединенного к N-концу проинсулина, через остаток лизина. Белок эффективно экспрессировался и локализовался в тельцах включения.
    После выделения белок расщеплялся трипсином с получением инсулина и С-пептида. Другая группа исследователей действовала аналогичным способом. Слитой белок, состоящий из проинсулина и двух синтетических доменов белка А стафилококков, связывающих IgG, локализовался в тельцах включения, но обладал более высоким уровнем экспрессии.
    Белок выделялся аффинной хроматографией с использованием IgG и обрабатывался трипсином и карбоксипептидазой В. Полученные инсулин и С-пептид очищались ОФ ВЭЖХ. При создании слитых конструкций весьма существенным является соотношение масс белка носителя и целевого полипептида.
    Так описано конструирование слитых конструкций, где в качестве полипептида- носителя использовали белок, связывающий сывороточный альбумин человека. К нему присоединяли один, три и семь С-пептидов.
    С-пептиды соединялись по принципу «голова-хвост» с помощью аминокислотных спейсеров, несущих сайт рестрикции Sfi I и два остатка аргинина в начале и в конце спейсера для последующего расщепления белка трипсином. ВЭЖХ продуктов расщепления показала, что отщепление С-пептида проходит количественно, а это позволяет использовать способ мультимерных синтетических генов для получения целевых полипептидов в промышленном масштабе.
    Получение мутанта проинсулина, который содержал замену Arg32Tyr. При совместном расщеплении этого белка трипсином и карбоксипептидазой В образовывался нативный инсулин и С-пептид содержащий остаток тирозина. Последний, после мечения 125I, активно используется в радиоиммунном анализе. [14] Инсулин, предназначенный для изготовления лекарственных препаратов, должен быть высокой чистоты. Поэтому необходим высокоэффективный контроль за чистотой получаемых продуктов на каждой стадии производства. Ранее с помощью ОФ и ИО (ионообменной) ВЭЖХ были охарактеризованы проинсулин-S-сульфонат, проинсулин, отдельные А- и В-цепи и их S-сульфонаты [13].
    Также особое внимание уделяется флуоресцентным производным инсулина [14]. В работе авторы исследовали применимость и информативность хроматографических методов при анализе продуктов всех стадий производства инсулина человека и составили регламент хроматографических операций позволяющий эффективно разделять и охарактеризовывать полученные продукты.
    Авторы разделяли производные инсулина используя бифункциональные сорбенты (гидрофобная и ионообменная ОФ ВЭЖХ) и показали возможность управления селективностью разделения путем варьирования вклада каждого из взаимодействий, благодаря чему достигается большая эффективность при разделении близких аналогов белка.
    Кроме того, разрабатываются подходы для автоматизации и ускорения процессов определения чистоты и количества инсулина.
    Сообщается об исследованиях возможности применения ОФ жидкостной хроматографии с электрохимическим детектированием для определения инсулина и разработана методика определения инсулина, выделенного из островка Лангерганса методом иммуноаффинной хроматографии со спектрометрическим детектированием.
    В работе исследовали возможность применения быстрого микроопределения инсулина с использованием капиллярного электрофореза с лазерно-флуоресцентным детектированием. Анализ выполняется путем добавления к пробе известного количества инсулина, меченного фенилизотиоцианатом (ФИТЦ) и фрагмента Fab моноклональных антител на инсулин. Меченый и обычный инсулины конкурентно вступают в реакцию образования комплекса с Fab. Меченый ФИТЦ инсулин и его комплекс с Fab разделяют за 30 секунд. [12] источник

  3. p5tar Ответить


    Инсулин – это основное лекарство для лечения больных сахарным диабетом 1 типа. Иногда он также используется для стабилизации состояния пациента и улучшения его самочувствия при втором типе заболевания. Это вещество по своей природе является гормоном, который способен в малых дозах влиять на обмен углеводов.
    В норме поджелудочная железа вырабатывает достаточное количество инсулина, который помогает поддерживать физиологический уровень сахара в крови. Но при серьезных эндокринных нарушениях единственным шансом помочь больному часто становятся именно инъекции инсулина.
    Принимать его перорально (в виде таблеток), к сожалению, нельзя, поскольку он полностью разрушается в пищеварительном тракте и утрачивает биологическую ценность.

    Варианты получения инсулина для использования в медицинской практике

    Многие диабетики наверняка хоть раз задавались вопросом, из чего делают инсулин, который применяется в медицинских целях? В настоящее время чаще всего это лекарство получают с помощью методов генной инженерии и биотехнологии, но иногда его извлекают из сырья животного происхождения.

    Препараты, получаемые из сырья животного происхождения

    Получение этого гормона из поджелудочной железы свиней и крупного рогатого скота – старая технология, которая сегодня используется довольно редко.
    Это связано с невысоким качеством получаемого лекарства, его склонностью вызывать аллергические реакции и недостаточной степенью очистки.
    Дело в том, что, поскольку гормон – это белковое вещество, оно состоит из определенного набора аминокислот.
    Инсулин, вырабатываемый в организме свиньи, отличается по аминокислотному составу от инсулина человека на 1 аминокислоту, а инсулин быка – на 3.
    В начале и середине 20 столетия, когда аналогичных препаратов не существовало, даже такой инсулин стал прорывом в медицине и позволил вывести лечение диабетиков на новый уровень. Гормоны, полученные таким методом, снижали сахар крови, правда, при этом они часто вызывали побочные эффекты и аллергию.
    Отличия в составе аминокислот и примеси в лекарстве сказывались на состоянии пациентов, особенно это проявлялось у более уязвимых категорий больных (детей и пожилых людей).
    Еще одна причина плохой переносимости такого инсулина – наличие его неактивного предшественника в лекарстве (проинсулина), избавиться от которого в данной вариации лекарства было невозможно.
    В наше время существуют усовершенствованные свиные инсулины, которые лишены этих недостатков. Их получают из поджелудочной железы свиньи, но после этого поддают дополнительной обработке и очистке. Они являются многокомпонентными и содержат в своем составе вспомогательные вещества.
    Модифицированный свиной инсулин практически ничем не отличается от человеческого гормона, поэтому его до сих пор используют на практике
    Такие лекарства переносятся пациентами гораздо лучше и практически не вызывают побочных реакций, они не угнетают иммунитет и эффективно снижают сахар в крови. Бычий инсулин на сегодняшний день в медицине не используется, так как из-за своей чужеродной структуры он отрицательно влияет на иммунную и другие системы организма человека.

    Генноинженерный инсулин

    Человеческий инсулин, который применяется для диабетиков, в промышленном масштабе получают двумя способами:
    Условия хранения инсулина
    с помощью ферментативной обработки свиного инсулина;
    с использованием генномодифицированных штаммов кишечной палочки или дрожжей.
    При физико-химическом изменении молекулы свиного инсулина под действием специальных ферментов становятся идентичными инсулину человека. Аминокислотный состав полученного препарата ничем не отличается от состава натурального гормона, который вырабатывается в организме людей.
    В процессе производства лекарство проходит высокую очистку, поэтому не вызывает аллергических реакций и других нежелательных проявлений.
    Но чаще всего инсулин получают с помощью модифицированных (генетически измененных) микроорганизмов. Бактерии или дрожжи с помощью биотехнологических методов изменены таким образом, что могут сами производить инсулин.
    Помимо самого получения инсулина, важную роль играет его очистка. Чтобы препарат не вызывал никаких аллергических и воспалительных реакций, на каждой стадии необходимо следить за чистотой штаммов микроорганизмов и всех растворов, а также используемых ингредиентов.
    Существует 2 методики подобного получения инсулина. Первая из них основана на использовании двух разных штаммов (видов) какого-то одного микроорганизма.
    Каждый из них синтезирует только одну цепь молекулы ДНК гормона (всего их две, и они спирально закручены между собой).
    Затем эти цепи соединяются, и в полученном растворе уже можно отделить активные формы инсулина от тех, которые не несут никакого биологического значения.
    Второй способ получения лекарства с помощью кишечной палочки или дрожжей основан на том, что микроб сначала производит неактивный инсулин (то есть его предшественник – проинсулин). Потом с помощью ферментативной обработки эту форму активируют и используют в медицине.
    Персонал, который имеет доступ в определенные производственные помещения, всегда должен быть одет в стерильный защитный костюм, благодаря чему контакт препарата с биологическими жидкостями человека исключается
    Все эти процессы обычно автоматизированы, воздух и все соприкасающиеся поверхности с ампулами и флаконами стерильны, а линии с оборудованием герметично закрыты.
    Методы биотехнологии дают возможность ученым думать об альтернативных решениях проблемы сахарного диабета.
    Например, на сегодняшний день проводятся доклинические исследования производства искусственных бета-клеток поджелудочной железы, которые могут быть получены с помощью методов генной инженерии.
    Возможно, в будущем их будут использовать для улучшения функционирования этого органа у больного человека.
    Производство современных препаратов инсулина – сложный технологический процесс, который предусматривает автоматизацию и минимальное вмешательство человека

    Дополнительные компоненты

    Производство инсулина без вспомогательных веществ в современном мире практически невозможно представить, ведь они позволяют улучшить его химические свойства, продлить время действия и достичь высокой степени чистоты.
    По своим свойствам все дополнительные ингредиенты можно разделить на такие классы:
    пролонгаторы (вещества, которые используются для обеспечения более длительного действия лекарства);
    дезинфицирующие компоненты;
    стабилизаторы, благодаря которым в растворе лекарства поддерживается оптимальная кислотность.

    Пролонгирующие добавки

    Существуют инсулины продленного действия, биологическая активность которых продолжается в течение 8 – 42 часов (в зависимости от группы препарата). Такой эффект достигается, благодаря добавлению в инъекционный раствор специальных веществ – пролонгаторов. Чаще всего с этой целью применяется одно из таких соединений:
    белки;
    хлористые соли цинка.
    Белки, которые продлевают действие лекарства, проходят детальную очистку и являются низкоаллергенными (например, протамин). Соли цинка также не оказывают отрицательного влияния ни на активность инсулина, ни на самочувствие человека.
    Дезинфекторы в составе инсулина необходимы для того, чтобы при хранении и использовании в нем не размножалась микробная флора. Эти вещества являются консервантами и обеспечивают сохранность биологической активности лекарства.
    К тому же, если пациент вводит гормон из одного флакона только самому себе, то лекарства ему может хватить на несколько дней.
    За счет качественных антибактериальных компонентов у него не будет потребности выбрасывать неиспользованный препарат из-за теоретической возможности размножения в растворе микробов.
    В качестве дезинфицирующих составляющих при производстве инсулина могут использоваться такие вещества:
    метакрезол;
    фенол;
    парабены.
    Если в растворе содержатся ионы цинка, они также выступают дополнительным консервантом из-за своих антимикробных свойств
    Для производства каждого вида инсулина подходят определенные дезинфицирующие компоненты. Их взаимодействие с гормоном обязательно исследуют на этапе доклинических испытаний, поскольку консервант не должен нарушать биологическую активность инсулина или как-то по-другому отрицательно влиять на его свойства.
    Использование консервантов в большинстве случаев позволяет вводить гормон под кожу без ее предварительной обработки спиртом или другими антисептиками (производитель обычно упоминает об этом в инструкции).
    Это упрощает введение лекарства и сокращает количество подготовительных манипуляций перед самой инъекцией.
    Но данная рекомендация работает только в случае введения раствора с помощью индивидуального инсулинового шприца с тонкой иглой.

    Стабилизаторы

    Стабилизаторы необходимы для того, чтобы pH раствора поддерживался на заданном уровне. От уровня кислотности зависит сохранность лекарства, его активность и стабильность химических свойств. При производстве инъекционного гормона для больных диабетом с этой целью обычно используют фосфаты.
    Для инсулинов с цинком стабилизаторы растворов нужны не всегда, поскольку ионы металла помогают поддерживать необходимый баланс.
    Если же они все-таки применяются, то вместо фосфатов используют другие химические соединения, так как комбинация этих веществ приводит к выпадению осадка и непригодности лекарства.
    Важное свойство, предъявляемое ко всем стабилизаторам – безопасность и отсутствие возможности вступать в любые реакции с инсулином.
    Подбором инъекционных лекарств при диабете для каждого конкретного пациента должен заниматься компетентный эндокринолог.
    Задача инсулина – не только удерживать нормальный уровень сахара в крови, но и не вредить другим органам и системам. Препарат должен быть нейтральным в химическом плане, низкоаллергенным и желательно доступным по цене.
    Довольно удобно также, если подобранный инсулин можно будет смешивать с другими его версиями по длительности действия.
    Источник: http://diabetiko.ru/raznoe/chego-proizvodyat

    Получение инсулина,методами генной инженерии, Биотехнология – Курсовая работа


    Введение 3
    Глава
    1. Строение и функции инсулина 5
    1.1. Строение молекулы инсулина 5
    1.2. Биологическое значение инсулина 7
    1.3. Биосинтез инсулина 8
    Глава
    2. Синтез инсулина методами генной инженерии 10
    2.1. Применение методов генной инженерии для синтеза лекарственных препаратов 10
    2.2. Методы генной инженерии 11
    2.3. Получение инсулина методами генной инженерии 14
    Заключение 18
    Литература 20
    Приложение 22

    Выдержка из текста

    При этом в составе гибридного белка оба эти компонента могут присутствовать одновременно. Кроме этого, при создании гибридных белков может использоваться принцип мультимерности — присутствия нескольких копий целевого полипептида в гибридном белке, что позволяет существенно повысить выход целевого продукта.
    В Великобритании синтезированы обе цепи человеческого инсулина с помощью E. coli, соединенные в молекулу биологически активного гормона. Чтобы одноклеточный организм мог синтезировать на своих рибосомах молекулы инсулина, необходимо снабдить его нужной программой, то есть ввести ему ген гормона.
    В Институте РАН с использованием генно-инженерных штаммов E. coli получен рекомбинантный инсулин. Из выращенной биомассы выделяется гибридный белок-предшественник, экспрессируемый в количестве
    40. от всего клеточного белка, содержащий препроинсулин.
    Превращение его в инсулин in vitro осуществляется в той же последовательности, что и in vivо — отщепляется лидирующий полипептид, препроинсулин превращается в инсулин через стадии окислительного сульфитолиза с последующим восстановительным замыканием трех дисульфидных связей и ферментативным вычленением связывающего С-пептида. После ряда включающих ионообменные, гелевые и ВЭЖХ хромотографических очисток получают человеческий инсулин высокой чистоты и природной активности.
    Для получения инсулина используют штамм со встроенной в плазмиду нуклеотидной последовательностью, экспрессирующей гибридный белок, состоящий из линейного проинсулина и фрагмента белка, А Staphylococcus aureus, присоединенного к его N-концу через остаток метионина [8, 9, 10].
    Культивирование насыщенной биомассы клеток рекомбинантного штамма обеспечивает начало производства гибридного белка, выделение и последовательная трансформация которого in tube приводят к инсулину.
    Возможен и другой путь: получение в бактериальной системе экспрессии рекомбинантного белка, состоящего из проинсулина человека и присоединенного к нему через остаток метионина полигистидинового «хвоста». Его выделяют с использованием хелатной хроматографии на колонках с Ni-агарозой и расщеплением бромцианом.
    Выделенный белок является S-сульфонированным. Картирование и масс-спектрометрический анализ полученного проинсулина, очищенного ионнообменной хроматографией на анионите и ОФ (обращеннофазовой) высокоэффективной жидкостной хроматографией, показывают наличие дисульфидных мостиков, которые соответствуют дисульфидным мостикам нативного проинсулина человека.
    В последнее время пристальное внимание уделяется упрощению процедуры получения рекомбинантного инсулина методами генной инженерии. Так, например, можно получать белок, состоящий из присоединенного к N-концу проинсулина через остаток лизина лидерного пептида интерлейкина
    2. Белок эффективно экспрессируется и локализуется в тельцах включения. После выделения белок с получением инсулина и С-пептида расщепляется трипсином [5, 8, 10].
    Полученные инсулин и С-пептид очищаются ОФ ВЭЖХ. Весьма существенным при создании слитых конструкций является соотношение масс белка носителя и целевого полипептида.
    С-пептиды с помощью аминокислотных спейсеров, несущих сайт рестрикции Sfi I и два остатка аргинина в начале и в конце спейсера для последующего расщепления белка трипсином, соединяются по принципу «голова-хвост».
    ВЭЖХ продуктов расщепления показывает, что отщепление С-пептида проходит количественно, а это позволяет использовать способ мультимерных синтетических генов для получения целевых полипептидов в промышленном масштабе.

    Заключение

    Радикальным, а в большинстве случаев единственным средством для поддержания жизни и трудоспособности больных сахарным диабетом до настоящего времени служит инсулин.
    До получения и внедрения инсулина в клиническую практику в течение одного-двух лет с начала заболевания больных сахарным диабетом I типа ждал летальный исход, несмотря на применение самых изнурительных диет.
    Больные сахарным диабетом I типа нуждаются в пожизненной заместительной терапии препаратами инсулина. Прекращение регулярного введения инсулина в силу тех или иных причин ведет к быстрому развитию осложнений и скорой гибели больного.
    В настоящее время по распространенности сахарный диабет находится на III месте после заболеваний сердечно-сосудистой системы и злокачественных опухолей. Распространенность сахарного диабета среди взрослого населения, по данным Всемирной организации здравоохранения, в большинстве регионов мира составляет 2−5% и имеет тенденцию к увеличению каждые
    1. лет количества больных почти в два раза. Численность инсулинзависимых больных, несмотря на очевидный прогресс в области здравоохранения, увеличивается с каждым годом и на текущий момент только в России составляет около 2 миллионов человек.
    Наиболее перспективными методами получения инсулина являются методы генной инженерии. Генно-инженерный инсулин получают раздельным получением цепей, А и В с использованием разных штаммов-продуцентов и последующим фолдингом молекулы, с последующим разделением изоформ, и синтез в клетках E. Coli проинсулина с его расщеплением трипсином и карбоксипептидазой и получением нативный инсулина.
    Создание препаратов отечественного генно-инженерного инсулина человека открывает новые возможности решения многих проблем диабетологии России для спасения жизни миллионов людей, страдающих сахарным диабетом.

    Литература

    Балаболкин М.И., Клебанова Е.М., Креминская В.М. Сахарный диабет: современные аспекты диагностики и лечения/ Доктор; под ред. Г. Л. Вышковского.-2005.- М.: РЛС-2005, 2004.- 960 с.
    Гавриков, А.В. Оптимизация биотехнологического производства субстанций рекомбинантных интерферонов человека: дис. … канд. биол. наук — М, 2003 г.
    Генно-инженерный инсулин человека. Повышение эффективности хроматографического разделения при использовании принципа бифункциональности. / Романчиков А.Б., Якимов С.А., Клюшниченко В.Е., Арутунян А.М., Вульфсон А.Н. // Биоограническая Химия, 1997 — 23, № 2
    Глик Б., Пастернак Дж. Контроль применения биотехнологических методов// Б. Глик, Дж. Пастернак / Молекулярная биотехнология = Molecular Biotechnology. — М.: Мир, 2002. — С. 517−532. — 589 с.
    Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. М.: Мир, 2002.
    Девис Р., Ботстайн Д, Рот Дж. Методы генетической инженерии. Генетика бактерий // Р. Девис, Д. Ботстайн, Дж. Рот / Пер. с англ.-М.: Мир.- 1984.- 176 с.
    Ермишин А.П. Генетически модифицированные организмы: мифы и реальность / А.П.Ермишин// Мн.: Тэхналогйя.- 2004. — 118 с.
    Основы фармацевтической биотехнологии: Учебное пособие / Т.П. Прищеп, В.С. Чучалин, К.Л. Зайков, Л.К. Михалева. — Ростов-на-Дону.: Феникс; Томск: Издательство НТЛ, 2006.
    Патрушев Л. И. Искусственные генетические системы. // Л. И. Патрушев/ М.: Наука.- 2004.
    Романчиков, А.Б. Генно-инженерный инсулин человека. Повышение эффективности хроматографического разделения при использовании принципа бифункциональности. / А.Б. Романчиков [и др.]

    // Биоограническая Химия. 1997. № 2. с. 23

    Рыбчин В. Н. Основы генетической инженерии// В. Н. Рыбчин / 2-е изд, перераб. и доп.: Учебник для вузов. СПб.: Изд-во СПбГТУ. — 2002. — 522 с.
    Щелкунов С. Н. Генетическая инженерия // Щелкунов С. Н. /Новосибирск: Сиб. унив. изд-во.-2008.
    Щелкунов, С.Н. Генетическая инженерия: учеб-справ. пособие. — 2-е, изд., испр. и доп. — Новосибирск: Сиб. унив. изд-во, 2004. — 496 с.
    http://www.biotechnolog.ru/ge/ge 31.htm
    http://microbiologu.ru
    http://www.mikrobiki.ru
    http://www.gmo-compass.org
    Приложение
    Рис.
    1. Схема расположения дисульфидных связей в молекуле инсулина.
    Рис.
    2. Схема расположения аминокислотных остатков в молекуле инсулина
    Влияние инсулина на ключевые ферменты метаболизма
    Печень Мышцы Жировая ткань Активация 1. Фосфодиэстераза 1. Фосфодиэстераза 1. ЛП-липаза
    2. Фосфофруктокиназа
    2. Фосфофруктокиназа
    2. Фосфофруктокиназа
    3. Пируваткиназа
    3. Пируваткиназа
    3. Пируваткиназа
    4. Пируватдегидрогеназный комплекс
    4. Пируватдегидрогеназный комплекс
    4. Ацетил-КоА-карбоксилаза
    5. Фосфатаза гликогенсинтазы и гликогенфосфорилазы
    5. Фосфатаза гликогенсинтазы б. Ацетил-КоА-карбоксилаза Индукция 1. Глюкокиназа 1. Глицеральдегидфосфат-дегидрогеназа
    2. Цитратлиаза
    2. Пальмитатсинтаза
    3. Пальмитатсинтаза
    4. Пируваткиназа
    5. Ацетил-КоА-карбоксилаза
    6. Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа Репрессия Фосфоенолпируваткарбоксикиназа
    Рис. 3 Схема биосинтеза инсулина в β-клетках островков Лангерганса. ЭР — эндоплазматический ретикулум. 1 — образование сигнального пептида; 2 — синтез препроинсулина; 3 — отщепление сигнального пептида; 4 — транспорт проинсулина в аппарат Гольджи; 5 — превращение проинсулина в инсулин и С-пептид и включение инсулина и С-пептида в секреторные гранулы; 6 — секреция инсулина и С-пептида.
    Рис.
    4. Общая схема синтеза инсулина из его предшественников
    Рис. 5 Синтез инсулина с помощью образования двух раздельных цепей
    18

  4. Qwerty3001 Ответить

    Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению генно-инженерного инсулина человека для изготовления лекарственных препаратов, применяемых при лечении сахарного диабета. Способ получения генно-инженерного инсулина человека осуществляют путем культивирования штамма-продуцента Escherichia coli JM 109/pPINS07, выделения телец включения, содержащих гибридный белок, далее проводят отмывку телец включения, растворение и восстановление дисульфидных связей проводят одновременно в буфере, дополнительно содержащем 5-10 мМ дитиотреитола, в течение 3-7 ч. Очистку регенерированного гибридного белка проводят в одну стадию ионнообменной хроматографией. Расщепление гибридного белка осуществляют совместным гидролизом трипсином и карбоксипептидазой Б при массовом соотношении гибридного белка, трипсина и карбоксипептидазы Б 4000:1-2:1. Очистку инсулина проводят гидрофобной хроматографией с последующей гель-фильтрацией, а выделение инсулина – кристаллизацией в присутствии солей цинка. Изобретение позволяет сократить процесс получения генно-инженерного инсулина человека и увеличить его выход. Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению генно-инженерного инсулина человека для изготовления лекарственных препаратов, применяемых при лечении сахарного диабета.
    С учетом основных достижений современной диабетологии и рекомендаций Всемирной организации здравоохранения европейские страны к 2001 году завершили переход на использование человеческих инсулинов. В связи с этим разработка способов получения инсулина с использованием методов ДНК-рекомбинантной технологии является актуальной задачей.
    Известен способ получения генно-инженерного инсулина человека, состоящий в культивировании штамма-продуцента Е. Coli, продуцирующего проинсулин, содержащий два синтетических IgG связывающих домена стафилококкового белка А. Схема выделения заключается в разрушении бактериальных клеток, получении телец включения, содержащих проинсулин, растворении телец включения, окислительном сульфитолизе проинсулина, его ренатурации, очистке ренатурированного белка аффинной хроматографией, расщеплении проинсулина протеолитическими ферментами (трипсином и карбоксипептидазой Б) и заключительной очистке инсулина высокоэффективной обращенно-фазовой жидкостной хроматографией. (Nilson J. , Jonasson P., Samuelsson E., Stahl S., Uhlen M. “Integrated production of human insulin and its C-peptide”, Journal of biotechnology, 1996, v.48, p. 241-250).
    Недостатками данного способа являются высокая себестоимость продукта и использование при получении инсулина детергента, который может присутствовать в целевом продукте.
    Известен способ получения генно-инженерного инсулина человека, состоящий в том, что культивируют клетки штамма-продуцента Е. Coli ДН5а /pVK.100, разрушают бактериальные клетки дезинтеграцией, отделяют тельца включения, содержащие гибридный белок, от водорастворимых примесей при помощи центрифугирования, растворяют тельца включения в буфере, содержащем 8 М мочевину, 1мМ дитиотреитол, 0,1 М трис-HCl, рН 8,0, в течение 12-16 ч. Нерастворившиеся примеси удаляют центрифугированием, после чего увеличивают концентрацию дитиотреитола до 10 мМ и восстанавливают дисульфидные связи при 4oС в течение 1 ч. Раствор разбавляют в 5 раз холодной водой, доводят рН до 4,5 и выдерживают 2 ч при 4oС для формирования осадка. Осадок, содержащий гибридный белок, отделяют центрифугированием и ренатурируют, быстро растворяют в холодной воде при рН 10-12, после чего разводят 10 мМ глициновым буфером рН 10,8 и выдерживают при oС в течение ночи. После ультрафильтрации раствор подвергают гель-фильтрации на колонке с сефадексом G-50 и элюируют 10 мМ глициновым буфером. Собирают фракции, содержащие гибридный белок, проводят ультрафильтрацию и лиофильно высушивают. Полученный гибридный белок растворяют в 0,08 М трис НС1 буфере, рН 7,5 до концентрации 10 мг/мл и расщепляют одновременно трипсином и карбоксипептидазой Б (соотношение карбоксипептидаза Б: трипсин: гибридный белок 0,3:1:10) при 37oС в течение 30 мин. Затем добавляют изопропанол до 40%. Смесь подвергают хроматографической очистке на колонке с ДЭАЕ-сефадексом А-25 и элюируют 0,05М трис НСl буфером, рН 7,5 с 40% изопропанола с линейным градиентом хлористого натрия от 0 до 0,1 м. После удаления изопропанола концентрацию хлористого натрия увеличивают до 25%, сдвигают рН до 2,0 и собирают осадок инсулина (Chen J.-Q., Zhang Н.-Т., Нu М. -Н. , Tang J.-G., “Production of human insulin in an E. Coli system with met-lys-human proinsulin as the expressed precursor” Applied Biochemistry and Biotechnology, 1995, v. 55, p. 5-15).
    К недостаткам известного способа относится использование гельфильтрации на начальных стадиях, что требует значительных объемов сорбента и большого количества ферментов, используемых при расщеплении гибридного белка.
    Известен наиболее близкий к заявленному способ получения генно-инженерного инсулина человека, включающий культивирование штамма-продуцента Escherichia coli JM109/pPINS07, разрушение бактериальных клеток дезинтеграцией, отделение телец включения, содержащих гибридный белок, их растворение в буфере, содержащем мочевину и дитиотреитол, ренатурацию и очистку ренатурированного гибридного белка путем осаждения примесных соединений в 40%-ном изопропаноле с последующей хроматографией на КМ-сефарозе, его последовательное расщепление трипсином и карбоксипептидазой Б, при этом продукты трипсинолиза хроматографируют на СП-сефарозе, уравновешенной 0,03-0,1 М аммоний-ацетатным буфером рН 5,0-6,0, содержащим 6 М мочевины, с элюцией фракций линейным градиентом хлористого натрия от 0 до 0,5 М в стартовом буфере, а полученную после расщепления карбоксипептидазой Б фракцию инсулина очищают методом обращеннофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ) с последующей гель-фильтрацией. (Пат. РФ 2141531, МКИ С 12 Р 21/02, опубл. 1999 г.) К недостаткам способа следует отнести использование значительных количеств мочевины на стадии хроматографии на SP-сефарозе (проблема последующей утилизации) и использование органических растворителей на стадии выделения рекомбинантного белка и стадии очистки инсулина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (проблема защиты окружающей среды при промышленном производстве).
    Изобретение решает задачу упрощения процесса.
    Поставленная задача решается за счет того, что в способе получения генно-инженерного инсулина человека, включающем культивирование штамма-продуцента Escherichia coli JM 109/pPINS07, разрушение клеток дезинтеграцией, отделение телец включения, содержащих гибридный белок, их растворение в буфере, содержащем мочевину и дитиотреитол, восстановление дисульфидных связей, ренатурацию и очистку ренатурированного гибридного белка, его расщепление трипсином и карбоксипептидазой Б с последующей очисткой и выделением инсулина, предварительно проводят отмывку телец включения, растворение белка и восстановление дисульфидных связей проводят одновременно в буфере с 5-10 мМ дитиотреитола и 1 мМ ЭДТА в течение 3-7 ч, очистку регенерированного гибридного белка проводят в одну стадию ионообменной хроматографией, расщепление гибридного белка проводят совместным гидролизом трипсином и карбоксипептидазой Б при массовом соотношении гибридного белка, трипсина и карбоксипептидазы Б 4000:1-2:1, очистку инсулина проводят гидрофобной хроматографией с последующей гель-фильтрацией, а выделение инсулина – кристаллизацией в присутствии солей цинка.
    Способ осуществляют следующим образом.
    Для получения генно-инженерного инсулина человека используют штамм бактерии Escherichia coli 1М109/рР1Н807-продуцент гибридного полипептида, содержащего проинсулин человека. Биосинтез продуцента проводят следующим образом.
    При культивировании клеток штамма-продуцента Escherichia coli JM 109/pPINS07 для получения иннокулята питательную среду на основе гидролизата казеина и экстракта пекарских дрожжей засевают культурой штамма-продуцента, затем выращивают посевной материал в ферментере объемом 10 л. Полученный посевной материал используют для засева ферментера объемом 100 л. Ферментацию проводят до достижения культурой оптической плотности 30 ОЕ, проводя индукцию синтеза гибридного белка изопропилтио--D-галактопиранозидом. После окончания ферментации клетки продуцента гибридного белка (биомассу) отделяют центрифугированием, разрушают на дезинтеграторе Гаулина и выделяют центрифугированием тельца включения.
    Тельца включения, полученные после дезинтеграции биомассы, обрабатывают по следующей схеме: 1. Тельца включения подвергают двукратной отмывке водой и 50 мМ трис-НСl при рН 9,0.
    2. Отмытые тельца включения растворяют в буфере, содержащем 50 мМ трис-НСl, 8,0 М мочевину, 1 мМ ЭДТА, 0,2 М NaСl, 5-10 мМ дитиотреитола, при рН 8,0. Осадок отделяют центрифугированием.
    3. Супернатант, содержащий восстановленный гибридный белок, разбавляют 25 мМ трис-НСl буфером с рН 8,5-9,5 или 25 мМ Na-глициновым буфером при рН 9,5-10,5, при 4-9oС так, чтобы концентрация общего белка составила 0,4-0,8 мг/мл. Раствор выдерживают при охлаждении и перемешивании в течение 72 ч.
    4. Очистку гибридного белка проводят хроматографией на ДЕАЕ-сефарозе FF, ДЕАЕ-тойоперле и т.п. или на SP-сефарозе FF, SP-тойоперле и т.п.
    5. К полученному раствору очищенного гибридного белка прибавляют раствор, содержащий карбоксипептидазу Б и трипсин, по окончании реакции (данные ВЭЖХ) гидролиз останавливают подкислением раствора до рН 3,0, прибавляют хлористый натрий, перемешивают в течение 30 мин и центрифугируют. Осадок передают на следующую стадию очистки.
    6. Осадок белка, содержащий инсулин, растворяют в 10 мМ лимонной кислоте, добавляют хлористый натрий до концентрации 1 М и доводят рН раствора до значения 6,1-6,5. Раствор центрифугируют и супернатант, содержащий инсулин, наносят на колонку, содержащую гидрофобный сорбент, уравновешенный исходным буферным раствором. Сорбированный материал элюируют линейным градиентом этилового спирта. Фракции, содержащие инсулин с чистотой не менее 98%, объединяют и передают на дальнейшую очистку.
    7. Раствор, содержащий инсулин, смешивают с равным количеством раствора 4 М хлористого натрия в 10 мМ лимонной кислоте, выдерживают при перемешивании на холоду, центрифугируют. Полученный осадок растворяют в 0,5 М уксусной кислоте, фильтруют и передают на гель-фильтрацию. Гельфильтрацию раствора инсулина проводят на колонке, содержащей сефадекс G-50 SF SG.
    8. К раствору инсулина, полученного на предыдущей стадии, добавляют ацетат цинка, доводят значение рН до 5,8-6,2 концентрированным раствором аммиака. Суспензию перемешивают в течение 2 ч, после чего центрифугируют. Полученный осадок промывают апирогенной водой, растворяют в 60 мМ лимонной кислоте, создавая концентрацию инсулина 4 мг/мл. Полученный раствор подвергают стерилизующей фильтрации, добавляют этиловый спирт до концентрации 15% и раствор хлористого цинка, значение рН доводят до 6,0-6,3 концентрированным аммиаком, перемешивают при 4-6oС в течение 4 ч и центрифугируют. Кристаллы последовательно промывают апирогенной водой, этиловым спиртом и абсолютным этиловым спиртом и высушивают в вакуумном сушильном шкафу.
    Изобретение иллюстрируют примеры.
    Пример 1.
    Культивирование клеток штамма-продуцента Escherichia coli JM109/pPINS07 проводят следующим образом: Для получения иннокулята питательную среду на основе гидролизата казеина и экстракта пекарских дрожжей засевают культурой штамма-продуцента, затем выращивают посевной материал в ферментере объемом 10 л. Полученный посевной материал используют для засева ферментера объемом 100 л. Ферментацию проводят до достижения культурой оптической плотности 30 ОЕ, проводя индукцию синтеза гибридного белка изопропилтио--D-галактопиранозидом.
    После окончания ферментации клетки продуцента гибридного белка (биомассу) отделяют центрифугированием, разрушают на дезинтеграторе Гаулин и выделяют центрифугированием тельца включения.
    250 г телец включения подвергают отмывке водой и 50 мМ трис-НСl при рН 9,0. Для этого тельца включения суспендируют в воде при массовом соотношении телец и воды 1:4 при перемешивании в течение 30 мин. Затем суспензию центрифугируют при 25000 g в течение 30 мин, супернатант сливают, а осадок отмывают в 50 мМ трис-НСl.
    Полученные тельца включения растворяют при постоянном перемешивании на магнитной мешалке в буферном растворе, содержащем 50 мМ трис-HCl, 8,0 М мочевину, 1 мМ ЭДТА, 0,2 М NaCl, 10 мМ дитиотреитол, при рН 8,0. Реакцию проводят в течение 3 ч при температуре 20oС. Нерастворившийся материал отделяют центрифугированием при 25000 g в течение 30 мин.
    Суммарное содержание белка, определяемое методом Лоури, составляет 28 г, содержание гибридного белка по данным SDS электрофореза 50%.
    Супернатант, содержащий восстановленный гибридный белок, разбавляют буфером 25 мМ трис-HCl, рН 9,0, охлажденным до 4oС так, чтобы концентрация общего белка составляла 0,4 мг/мл. Раствор выдерживают при охлаждении и перемешивании в течение 72 ч.
    Очистку гибридного белка проводят хроматографией на ДЕАЕ-сефарозе FF. Ha колонку диаметром 113 мм, содержащую 1,5 л ДЕАЕ-сефарозы FF и уравновешенную 25 мМ трис-НСl-буфером с рН 7,5, наносят раствор ренатурированного гибридного белка. Сорбированный белок элюируют с колонки градиентом соли от 0 до 0,3 М хлористого натрия в исходном буфере. Фракции, содержащие гибридный белок, объединяют и используют для получения инсулина. Выход ренатурированного гибридного белка со степенью чистоты 93-98% составляет 9 г.
    Содержание гибридного белка определяют по величине оптической плотности раствора при 280 нм.
    К 900 мл полученного раствора с рН 7,5, содержащего 9 г гибридного белка, прибавляют свежеприготовленный раствор 4,5 мг трипсина в соляной кислоте, раствор, содержащий 2,25 мг карбоксипептидазы Б (в массовом соотношении 4000: 2:1) и перемешивают на магнитной мешалке при температуре 37oС в течение 1 ч. По окончании реакции гидролиз останавливают подкислением раствора соляной кислотой до рН 3,0. Степень гидролиза гибридного белка составляет не менее 95%. Содержание инсулина в реакционной среде по данным ОФ ВЭЖХ составляет 2,3 г.
    К подкисленному раствору гидролизата гибридного белка прибавляют хлористый натрий до концентрации 2М, перемешивают в течение 30 мин и центрифугируют при 25000 g. Супернатант сливают, а осадок передают на следующую стадию очистки.
    Осадок белка, содержащий 2,3 г инсулина, растворяют в 10 мМ лимонной кислоте, прибавляют хлористый натрий до концентрации 1 М и доводят рН раствора до значения 6,1. Опалесцирующий раствор центрифугируют и супернатант наносят на колонку размером 5/60 см, содержащую 0,8 л Butyl-Toyopearl 650, предварительно уравновешенную 10 мМ нитратным буфером с 1 М хлоридом натрия, рН 6,1. Сорбент промывают исходным буферным раствором, затем этим же буфером в условиях линейно понижающейся концентрации хлористого натрия от 1 до 0 М и 10 мМ цитратным буфером с рН 6,1. Инсулин элюируют линейным градиентом этилового спирта от 0 до 25% в 10 мМ цитратном буфере. Собранные фракции белкового раствора анализируют методом ОФ ВЭЖХ. Фракции, содержащие инсулин с чистотой не менее 98% (1,05 г), объединяют и передают на дальнейшую очистку. Белковые фракции, содержащие инсулин с более высоким содержанием примесей, объединяют и направляют на дополнительную очистку.
    Раствор, содержащий 1,05 г инсулина, смешивают с равным количеством раствора 4 М хлористого натрия в 10 мМ лимонной кислоте, выдерживают при перемешивании в холодильнике в течение 2 ч, центрифугируют 20 мин при 20 000 g. Полученный осадок растворяют в 0,5 М уксусной кислоте, фильтруют и передают на гель-фильтрацию. Гель-фильтрацию раствора инсулина проводят на колонке размером 5/100 см, содержащей 1,7 л сефадекса G-50 SF SG, предварительно уравновешенного 0,5 М раствором уксусной кислоты. Полученные фракции анализируют методом эксклюзионной ВЭЖХ и объединяют фракции, содержащие инсулин без высоко- и низкомолекулярных примесей. Выход инсулина на данной стадии составляет 0,9 г.
    К 200 мл раствора инсулина в 0,5 М уксусной кислоте, содержащего 0,9 г инсулина, добавляют ацетат цинка до концентрации 0,05 М, доводят значение рН до 6,0 концентрированным раствором аммиака. Суспензию перемешивают на магнитной мешалке при 4oС в течение 2 ч, после чего центрифугируют при 20000 g в течение 15 мин. Супернатант сливают, а осадок промывают апирогенной водой и вновь центрифугируют. Осадок инсулина растворяют в 60 мМ лимонной кислоте с концентрацией 4 мг/мл. Полученный раствор подвергают стерильной фильтрации, добавляют этиловый спирт до общей концентрации 15% и 3,5 мл 5%-ного раствора хлористого цинка, после чего значение рН доводят 6,2. Слегка опалесцирующий раствор оставляют медленно перемешиваться при 4oС в течение 4 ч, затем центрифугируют при 5000 g в течение 15 мин. Супернатант сливают, осадок последовательно промывают апирогенной водой (дважды), этиловым спиртом и абсолютным этиловым спиртом (дважды). Кристаллы высушивают в вакуумном сушильном шкафу.
    Выход кристаллического инсулина составляет 0,8 г.
    Пример 2.
    Культивирование клеток штамма-продуцента Escherichia coli JM109/pPINS07 проводят следующим образом.
    Для получения иннокулята питательную среду на основе гидролизата казеина и экстракта пекарских дрожжей засевают культурой штамма-продуцента, затем выращивают посевной материал в ферментере объемом 10 л. Полученный посевной материал используют для засева ферментера объемом 100 л. Ферментацию проводят до достижения культурой оптической плотности 30 ОЕ, проводя индукцию синтеза гибридного белка изопропилтио--D-галактопиранозидом.
    После окончания ферментации клетки продуцента гибридного белка (биомассу) отделяют центрифугированием, разрушают на дезинтеграторе Гаулина и выделяют центрифугированием тельца включения.
    250 г телец включения подвергают отмывке водой и 50 мМ трис-НСl при рН 9,0. Для этого тельца включения суспендируют в воде при массовом соотношении телец и воды 1:20 при перемешивании в течение 30 мин. Затем суспензию центрифугируют при 25000 g в течение 30 мин, супернатант сливают, а осадок отмывают в 50 мМ трис-HCl.
    Полученные тельца включения растворяют при постоянном перемешивании на магнитной мешалке в буферном растворе, содержащем 50 мМ трис-HCl, 8,0 М мочевину, 1 мМ ЭДТА, 0,2 М NaCl, 5 мМ дитиотреитол, при рН 8,0. Реакцию проводят в течение 7 ч при температуре 20oС. Нерастворившийся материал отделяют центрифугированием при 25000 g в течение 30 мин.
    Суммарное содержание белка, определяемое методом Лоури, составляет 25 г, содержание гибридного белка по данным SDS электрофореза 50%.
    Супернатант, содержащий, восстановленный гибридный белок, разбавляют 25 мМ Na-глициновым буфером, рН 10,0, охлажденным до 9oС так, чтобы концентрация общего белка составила 0,8 мг/мл. Раствор выдерживают при охлаждении и перемешивании в течение 72 ч.
    Очистку гибридного белка проводят хроматографией на SP-сефарозе FF.
    На колонку диаметром 113 мм, содержащую 1,5 л SP-сефарозы FF, уравновешенную 25 мМ трис-НСl-буфером с рН 7,5, наносят раствор ренатурированного гибридного белка с рН 7,5. Сорбированный белок элюируют с колонки градиентом соли от 0 до 0,7 М хлористого натрия в исходном буфере. Фракции, содержащие гибридный белок, объединяют и используют для получения субстанции инсулина. Выход ренатурированного гибридного белка со степенью чистоты 93-96% составляет 8,1 г.
    Содержание гибридного белка определяют по величине оптической плотности раствора при 280 нм.
    К 800 мл полученного раствора, содержащего 8,1 г гибридного белка (рН раствора 7,5), прибавляют свежеприготовленный раствор 2,025 мг трипсина в соляной кислоте, раствор, содержащий 2,025 мг карбоксипептидазы Б (в массовом соотношении 4000:1:1). Через 2 ч гидролиз останавливают подкислением раствора соляной кислотой до рН 3,0. Степень гидролиза гибридного белка составляет не менее 95%. Содержание инсулина в реакционной среде по данным ОФ ВЭЖХ составляет 2,1 г.
    К подкисленному раствору гидролизата гибридного белка прибавляют хлористый натрий до концентрации 2М, перемешивают в течение 30 мин при 20oС и центрифугируют 25 мин при 25000 g. Супернатант сливают, а осадок передают на следующую стадию очистки.
    Осадок белка, содержащий 2,1 г инсулина, растворяют в 10 мМ лимонной кислоте, добавляют хлористый натрий до концентрации 1 М и доводят рН раствора до значения 6,5. Опалесцирующий раствор центрифугируют и супернатант наносят на колонку размером 5/60 см, содержащую 0,8 л Butyl-Toyopearl 650, предварительно уравновешенную 10 мМ цитратным буфером с 1 М хлоридом натрия, рН 6,5. Сорбент промывают исходным буферным раствором до выхода самописца на базовую линию со скоростью элюции 25 см/ч, затем этим же буфером в условиях линейно понижающейся концентрации хлористого натрия от 1 до 0 М и 10 мМ цитратным буфером, рН 6,5. Сорбированный материал элюируют линейным градиентом этилового спирта от 0 до 20% в 10 мМ цитратном буфере. Фракции белкового раствора анализируют методом ОФ ВЭЖХ. Фракции, содержащие инсулин с чистотой не менее 98%, объединяют и передают на дальнейшую очистку. Выход инсулина 0,95 г. Белковые фракции, содержащие инсулин с более высоким содержанием примесей, объединяют и направляют на дополнительную очистку.
    Раствор, содержащий 0,95 г инсулина, смешивают с равным количеством раствора 4 М хлористого натрия в 10 мМ лимонной кислоте, выдерживают при перемешивании в холодильнике в течение 2 ч, центрифугируют 20 мин при 20000 g. Полученный осадок растворяют в 1,0 М растворе уксусной кислоты, фильтруют и передают на гель-фильтрацию. Гель-фильтрацию раствора инсулина проводят на колонке размером 5/100 см, содержащей 1,7 л сефадекса G-50 SF SG, предварительно уравновешенного 1,0 М раствором уксусной кислоты. Нанесение раствора инсулина и элюцию проводят со скоростью 10 см/ч. Полученные фракции анализируют методом эксклюзионной ВЭЖХ и объединяют фракции, содержащие инсулин с минимальным содержанием высоко- и низкомолекулярных примесей. Выход инсулина на данной стадии составляет 0,8 г.
    К 250 мл раствора инсулина в 0,5 М уксусной кислоте, содержащего 0,8 г инсулина, добавляют ацетат цинка до концентрации 0,1 М, доводят значение рН до 6,0 концентрированным раствором аммиака. Суспензию перемешивают на магнитной мешалке при 6oС в течение 2 ч, после чего центрифугируют при 20000 g в течение 15 мин. Супернатант сливают, а осадок промывают апирогенной водой и вновь центрифугируют. Осадок инсулина растворяют в 60 мМ лимонной кислоте с концентрацией 3,5 мг/мл. Полученный раствор подвергают стерильной фильтрации, добавляют этиловый спирт до общей концентрации 14,7% и 3,0 мл 5%-ного раствора хлористого цинка, после чего значение рН доводят до 6,4. Слегка опалесцирующий раствор оставляют медленно перемешиваться на магнитной мешалке при 6oС в течение 4 ч, затем центрифугируют при 5000 g в течение 15 мин. Супернатант сливают, осадок последовательно промывают апирогенной водой (дважды), этиловым спиртом и абсолютным этиловым спиртом (дважды). Кристаллы высушивают в вакуумном сушильном шкафу.
    Выход кристаллического инсулина составляет 0,7 г.Формула изобретения
    Способ получения генно-инженерного инсулина человека, включающий культивирование штамма-продуцента Escherichia coli JM 109/pPINS07, разрушение клеток дезинтеграцией, отделение телец включения, содержащих гибридный белок, их растворение в буфере, содержащем мочевину и дитиотреитол, восстановление дисульфидных связей, ренатурацию и очистку ренатурированного гибридного белка, его расщепление трипсином и карбоксипептидазой Б с последующей очисткой и выделением инсулина, отличающийся тем, что предварительно проводят отмывку телец включения, растворение белка и восстановление дисульфидных связей проводят одновременно в буферном растворе, дополнительно содержащем 5-10 мМ дитиотреитола, в течение 3-7 ч, очистку ренатурированного гибридного белка проводят в одну стадию с использованием ионнообменных сорбентов с ДЕАЕ- или SP-группами, расщепление гибридного белка проводят совместным гидролизом трипсином и карбоксипептидазой Б при массовом соотношении гибридного белка, трипсина и карбоксипептидазы Б 4000:1-2:1, очистку инсулина проводят гидрофобной хроматографией с использованием сорбента Butyl-Toyopearl 650 c последующей гель-фильтрацией, а выделение – кристаллизацией в присутствии солей цинка.

  5. Dulaev23 Ответить

    Инсулин — гормон поджелудочной железы, регулирующий углеводный обмен и поддерживающий нормальный уровень саха­ра в крови. Недостаток этого гормона в организме приводит к одному из тяжелейших заболеваний — сахарному диабету, кото­рый как причина смерти стоит на третьем месте после сердечно­сосудистых заболеваний и рака.
    Инсулин — небольшой глобуляр­ный белок, содержащий 51 аминокислотный остаток и состоя­щий из двух полипептидных цепей, связанных между собой двумя дисульфидными мостиками.
    1- Синтезируется он в виде одноцепочечного предшественника — препроинсулина(106 а/к)
    2- При удалении сигналь­ного пептида в клетке образуется проинсулиниз 86 аминокислот­ных остатков, в котором А и В-цепи инсулина соединены С-пептидом, обеспечивающим им необходимую ориентацию при за­мыкании дисульфидных связей.
    3- После протеолитического отщеп­ления С-пептида образуется инсулин.(51)
    Известно несколько форм сахарного диабета. Самая тяжелая форма, для лечения которой больному необходим инсулин (инсулинзависимая форма заболевания), вызвана избирательной гибе­лью клеток, синтезирующих этот гормон (клетки островков Лангерганса в поджелудочной железе). Форма сахарного диабета, для лечения которой инсулин не требуется, распространена чаще, с ней удается справляться с помощью соответствующих диет и режи­ма. Обычно поджелудочная железа крупного рогатого скота и свиней не используется в мясной и консервной промышленности и постав­ляется в вагонах-рефрижераторах на фармацевтические предприя­тия, где проводят экстракцию гормона. Для получения 100 г крис­таллического инсулина необходимо 800 —1000 кг исходного сырья.
    В 1980 г. дат­ская компания «Ново индаетри» разработала метод превращения инсулина свиньи в инсулин человека путем замещения 30-го ос­татка аланина в цепи В на остаток треонина. Оба инсулина не раз­личались по активности и времени действия.
    Работы по генно-инженерному получению инсулина начались около 20 лет назад. В 1978 г. появилось сообщение о получении штамма кишечной палочки, продуцирующего крысиный проинсулин (США). В этом же году были синтезированы отдельные цепи человеческого инсулина посредством экспрессии их синтетических генов в клет­ках Е. coli

    Полученный синтетический ген был встроен вместе с фрагмен­том природной ДНК, содержащим промотор и проксимальную часть гена белка Р-галактозидазы кишечной палочки Е. сой, в плазмиду Полученная рекомбинантная плазмида рЕк бьша трансформиро­вана в клетки Е. coli. В результате экспрессии встроенного гена бактерия начала продуцировать гибридный (химерный) белок, со­держащий на N-конце участок (З-галактозидазы, а на С-конце — последовательность нейропептида. С помощью бромциана химер­ный белок расщепляли in vitro и получали активный лейцин-энкефалин. На рис. 1. представлены схема клонирования синтетичес­кого гена лейцин-энкефалина и его экспрессия в клетках кишеч­ной палочки.

  6. ReDvAlL Ответить

    Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны. Генная инженерия позволяет путем операций в пробирке переносить генетическую информацию из одного организма в другой.
    Перенос генов дает возможность преодолевать межвидовые барьеры и передавать отдельные наследственные признаки одних организмов другим. Цель прикладной генетической инженерии заключается в конструировании таких рекомбинантных молекул ДНК, которые при внедрении в генетический аппарат придавали бы организму свойства, полезные для человека.
    Отбор генетически модифицированных организмов ГМО и устранение тех, которые не были успешно модифицированы. Генная инженерия – это раздел молекулярной генетики, связанный с целенаправленным созданием новых комбинаций генетического материала. Основа генетической инженерии – теория гена. Созданный генетический материал способен размножаться и синтезировать конечные продукты обмена. Так же область биотехнологий, включающая в себя действия по перестройке генотипов.
    Уже сегодня генная инженерия позволяет включать и выключать отдельные гены, контролируя таким образом деятельность организмов, а также — переносить генетические инструкции из одного организма в другой, в том числе – организмы другого вида. По мере того, как генетики всё больше узнают о работе генов и белков, всё более реальной становится возможность произвольным образом программировать генотип прежде всего, человеческий , с лёгкостью достигая любых результатов: таких, как устойчивость к радиации, способность жить под водой, способность к регенерации повреждённых органов и даже бессмертие.
    Генетическая инженерия возникла в году, в Станфордском университете, в США. Тогда лаборатория П. Гибридная ДНК имеет вид кольца. Она содержит ген или гены и вектор. Вектор – это фрагмент ДНК, обеспечивающий размножение гибридной ДНК и синтез конечных продуктов деятельности генетической системы – белков. Большая часть векторов получена на основе фага лямбда, из плазмид, вирусов SV40, полиомы, дрожжей и др.
    Синтез белков происходит клетке-хозяине. Наиболее часто в качестве клетки- хозяина используют кишечную палочку, однако применяют и др. Система вектор-хозяин не может быть произвольной: вектор подгоняется к клетке-хозяину.
    Выбор вектора зависит от видовой специфичности и целей исследования. Ключевое значение в конструировании гибридной ДНК несут два фермента. Первый – рестриктаза – рассекает молекулу ДНК на фрагменты по строго определенным местам. Только после выделения таких ферментов создание искусственных генетических структур стало технически выполнимой задачей. Генная инженерия применительно к человеку. В применении к человеку генная инженерия могла бы применяться для лечения наследственных болезней.
    Однако, технически, есть существенная разница между лечением самого пациента и изменением генома его потомков. Задача изменения генома взрослого человека несколько сложнее, чем выведение новых генноинженерных пород животных, поскольку в данном случае требуется изменить геном многочисленных клеток уже сформировавшегося организма, а не одной лишь яйцеклетки-зародыша.
    Для этого предлагается использовать вирусные частицы в качестве вектора. Вирусные частицы способны проникать в значительный процент клеток взрослого человека, встраивая в них свою наследственную информацию; возможно контролируемое размножение вирусных частиц в организме.
    При этом для уменьшения побочных эффектов учёные стараются избегать внедрения генноинженерных ДНК в клетки половых органов, тем самым избегая воздействия на будущих потомков пациента. Также стоит отметить значительную критику этой технологии в СМИ: разработка генноинженерных вирусов воспринимается многими как угроза для всего человечества.
    С помощью генотерапии в будущем возможно изменение генома человека. В настоящее время эффективные методы изменения генома человека находятся на стадии разработки и испытаний на приматах. Долгое время генетическая инженерия обезьян сталкивалась с серьёзными трудностями, однако в году эксперименты увенчались успехом: в журнале Nature появилась публикация об успешном применении генноинженерных вирусных векторов для исцеления взрослого самца обезьяны от дальтонизма.
    В этом же году дал потомство первый генетически модифицированный примат выращенный из модифицированной яйцеклетки — игрунка обыкновенная. Хотя и в небольшом масштабе, генная инженерия уже используется для того, чтобы дать шанс забеременеть женщинам с некоторыми разновидностями бесплодия. Для этого используют яйцеклетки здоровой женщины. Ребёнок в результате наследует генотип от одного отца и двух матерей.
    Однако возможность внесения более значительных изменений в геном человека сталкивается с рядом серьёзных этических проблем. В году в США был начат проект “Геном человека”, целью которого было определить весь генетический код человека. Проект, в котором важную роль сыграли и российские генетики, был завершён в году. Завершение проекта уже принесло практические результаты, например, простые в применении тесты, позволяющие определять генетическую предрасположенность ко многим наследственным заболеваниям.
    Высказаны, например, надежды, что, благодаря расшифровке генома, уже к году будут разработаны препараты для лечения такого опасного заболевания, как СПИД, к году будут определены гены, которые связаны со злокачественными новообразованиями, а к году будут установлены механизмы возникновения почти всех видов рака.
    К году может быть завершена разработка препаратов, предотвращающих рак. Генная инженерия находит широкое практическое применение в отраслях народного хозяйства, таких как микробиологическая промышленность, фармакологическая промышленность, пищевая промышленность и сельское хозяйство. Одним из наиболее значимых отраслей в генной инженерии является производство лекарственных препаратов.
    Современные технологии производства различных лекарств позволяют излечивать тяжелейшие заболевания, или хотя бы замедлять их развитие. С помощью генной инженерии исследователи из Университета Пенсильвании представили новый метод производства вакцин: с помощью генетически сконструированных грибов.
    В результате был ускорен процесс производства вакцин, что может, по мнению пенсильванцев, пригодиться в случае биотеррористической атаки или вспышки птичьего гриппа. Логичным дополнением нокаута является искусственная экспрессия, то есть добавление в организм гена, которого у него ранее не было.
    Этот способ генной инженерии также можно использовать для исследования функции генов. В сущности процесс введения дополнительных генов таков же, как и при нокауте, но существующие гены не замещаются и не повреждаются. Используется, когда задачей является изучение локализации продукта гена. Одним из способов мечения является замещение нормального гена на слитый с репортёрным элементом, например, с геном зелёного флуоресцентного белка. В таких экспериментах задачей является изучение условий экспрессии гена.
    Он изучал вопросы адаптации и микроэволюции животных, имеющие ключевое значение в создании новых типов животных, приспособленных к экстремальным условиям, а также трансплантации зигот в племенном овцеводстве. В Научноэкспериментальном центре по биотехнологии и воспроизводству животных им.
    Мухамедгалиева разработаны методы селекции зигот и эмбрионов, повышающие их выживаемость при трансплантации, методы криоконсервации замораживания гамет и эмбрионов. Фундаментальные исследования позволили создать на основе отдаленной межвидовой гибридизации новую породу овец казахский архаромеринос и свиней семиреченскую, адаптированных к условиям Казахстана.
    Кузьминым, который развил ряд теоретических и методических основ селекции и семеноводства зерновых, масличных и других культур в Северном Казахстане. Профессор Н. Удолъская обосновала теоретически новый взгляд на засухоустойчивость растений. Она является автором четырех районированных сортов пшеницы и серии моногамных линий по сорту Казахстанская Большой вклад в развитие селекции зерновых растений был сделан Р.
    Им выведены десятки высокоурожайных сортов озимой пшеницы. Благодаря работам казахстанских селекционеров Казахстан сравнительно легко пережил все перемены в сельском хозяйстве, вызванные развалом СССР.
    И хотя площадь посевов сократилась в 2 раза, Казахстан продолжал и продолжает производить, как и прежде, около млн т зерна в год. Этого удалось добиться, благодаря внедрению новых сортов пшеницы, урожайность которых в 2 раза выше. Трансгенез — это процесс введения чужеродного гена, называемого трансгеном, в живой организм. При этом организм получает свойства, которые он может передавать потомству.
    Трансгенные организмы могут экспрессировать чужеродные гены, так как генетический код одинаков для всех живых организмов. Это означает, что последовательность ДНК будет кодировать одинаковую аминокислотную последовательность во всех организмах.
    Животные или растения, в которых произведены изменения геномов путем парасексуальных операций называюттрансгенными, а методология, использующая трансгенных животных, называется трансгеноз. В самом общем виде трансгеноз может быть определен как перенос генов из одного организма в другой путем операций invitro. Три критические точки в трансгенозе: интеграция трансгена, его экспрессия и трансмиссия, т. С помощью трансгеноза становиться понятно, как на уровне всего организма работают промоторы, энхансеры, механизм действия транскрипционных факторов, роль метилирования ДНК.
    Широко применяется в области иммунологии, и в области эмбриогенеза, и в области развития нервной системы, и в области механизмов кроветворения и ангиогенеза и в исследовании факторов, определяющих рост и дифференцировку мультипотентных стволовых клеток и, наконец, в области канцерогенеза.
    Трансгенные животные являются удобным объектом для анализа роли отдельных элементов гена в регуляции его работы. Так, сопоставление характера экспрессии введенного гена у животных, различающихся по длине фланкирующих последовательностей инъецированной ДНК, дает возможность обнаружить элементы гена, контролирующие его работу в разных типах тканей.
    Для облегчения анализа регуляторных последовательностей гена часто вводят генетические конструкции, сочетающие эти элементы с геном- репортером, экспрессия которого выражается в появлении известной и легко определяемой ферментативной активности. Важной составной частью биотехнологии является генетическая инженерия.
    Родившись в начале х годов, она добилась сегодня больших успехов. Методы генной инженерии преобразуют клетки бактерий, дрожжей и млекопитающих в “фабрики” для масштабного производства любого белка.
    Это дает возможность детально анализировать структуру и функции белков и использовать их в качестве лекарственных средств. Генетическая инженерия служит для получения желаемых качеств изменяемого или генетически модифицированного организма. Примерами применения генной инженерии являются получение производство человеческого инсулина путём использования генномодифицированных бактерий, производство эритропоэтина в культуре клеток или новых пород экспериментальных мышей для научных исследований.
    При помощи генной инженерии можно получать потомков с улучшенной внешностью, умственными и физическими способностями, характером и поведением. С помощью генотерапии в будущем возможно улучшение генома и ныне живущих людей. В принципе можно создавать и более серьёзные изменения, но на пути подобных преобразований человечеству необходимо решить множество этических проблем.
    Биологический энциклопедический словарь, М. Попов Л. Принципы конструирования рекомбинантных противовирусных вакцин. Получение соответствующего фрагмента нуклеиновой кислоты. Выбор высокоактивной и хорошо изученной в иммунологическом отношении модели вектора-носителя и клонирование соответствующего гена. Главная цель международной программы “Геном человека”. Патентное законодательство в области генной инженерии.
    Тестирования наследственных заболеваний. Определение генетически модифицированных организмов.

    Получение инсулина в биотехнологии кратко

    Понятие о генной инженерии. Рекомбинантные ДНК, конструирования их принципы. Клонирование фрагментов нуклеиновых кислот in Определение. Векторы: бактериофаги, плазмиды, космиды, искусственные хромосомы. Методы специфических поиска рекомбинантных ДНК. Трансгенные организмы. Принцип трансгенных конструирования организмов.

  7. Boro87 Ответить

    Инсулин
    человека можно производить четырьмя способами:
    1) полным
    химическим синтезом;
    2)
    экстракцией из поджелудочных желез человека (оба этих способа не подходят из-за
    неэкономичности: недостаточной разработанности первого способа и недостатка
    сырья для массового производства вторым способом);
    3)
    полусинтетическим методом с помощью ферментно-химической замены в положении 30
    В-цепи аминокислоты аланина в свином инсулине на треонин;
    4)
    биосинтетическим способом по генноинженерной технологии. Два последних метода
    позволяют получить человеческий инсулин высокой степени очистки.
    В настоящее
    время инсулин человека, в основном, получают двумя способами: модификацией
    свиного инсулина синтетико-ферментативным методом и генно-инженерным способом.
    Инсулин
    оказался первым белком, полученным для коммерческих целей с использованием
    технологии рекомбинантной ДНК. Существует два основных подхода для получения
    генно-инженерного инсулина человека.
    В первом
    случае осуществляют раздельное (разные штаммы-продуценты) получение обеих цепей
    с последующим фолдингом молекулы (образование дисульфидных мостиков) и
    разделением изоформ.
    Во втором –
    получение в виде предшественника (проинсулина) с последующим ферментативным
    расщеплением трипсином и карбоксипептидазой В до активной формы гормона.
    Наиболее предпочтительным в настоящее время является получение инсулина в виде
    предшественника, обеспечивающее правильность замыкания дисульфидных мостиков (в
    случае раздельного получения цепей проводят последовательные циклы денатурации,
    разделения изоформ и ренатурации).
    При обоих
    подходах возможно как индивидуальное получение исходных компонентов (А- и
    В-цепи или проинсулин), так и в составе гибридных белков. Помимо А- и В-цепи
    или проинсулина, в составе гибридных белков могут присутствовать:
    – белок
    носитель, обеспечивающий транспортировку гибридного белка в периплазматическое
    пространство клетки или культуральную среду;
    – аффинный
    компонент, существенно облегчающий выделение гибридного белка.
    При этом оба
    эти компонента могут одновременно присутствовать в составе гибридного белка.
    Кроме этого, при создании гибридных белков может использоваться принцип мультимерности,
    (то есть, в гибридном белке присутствует несколько копий целевого полипептида),
    позволяющий существенно повысить выход целевого продукта.
    В
    Великобритании с помощью E.coli синтезированы обе цепи человеческого инсулина,
    которые затем были соединены в молекулу биологически активного гормона. Чтобы
    одноклеточный организм мог синтезировать на своих рибосомах молекулы инсулина,
    необходимо снабдить его нужной программой, то есть ввести ему ген гормона.
    Химическим
    способом получают ген, программирующий биосинтез предшественника инсулина или
    два гена, программирующие в отдельности биосинтез цепей А и В инсулина.
    Следующий
    этап – включение гена предшественника инсулина (или гены цепей порознь) в геном
    E.coli – особого штамма кишечной палочки, выращенного в лабораторных условиях.
    Эту задачу выполняет генная инженерия.
    Из E.coli
    вычленяют плазмиду соответствующей рестриктазой. синтетический ген встраивается
    в плазмиду (клонированием с функционально активной С-концевой частью
    β-галактозидазы E.coli). В результате E.coli приобретает способность
    синтезировать белковую цепь, состоящую из галактозидазы и инсулина.
    Синтезированные полипептиды отщепляют от фермента химическим путем, затем
    проводят и очистку. В бактериях синезируется около100000 молекул инсулина на
    бактериальную клетку.
    Природа
    гормонального вещества, продуцируемого E.coli, обусловлена тем, какой ген
    встраивается в геном одноклеточного организма. Если клонирован ген
    предшественника инсулина, бактерия синтезирует предшественник инсулина, который
    подвергается затем обработке рестриктазами для отщепления препитида с
    вычленением С-пептида, вследствие чего получается биологически активный
    инсулин.
    Для получения
    очищенного инсулина человека выделенный из биомассы гибридный белок подвергают
    химко-ферментативной трансформации и соответствующей хроматографической очистке
    (фпрнтальной, гельпроникающей, анионообменной).
    В Институте
    РАН получен рекомбинантный инсулин с использованием генно-инженерных штаммов
    E.coli. из выращенной биомассы выделяется предшественник, гибридный белок,
    экспрессируемый в количестве 40% от всего клеточного белка, содержащий
    препроинсулин. Превращение его в инсулин in vitroосуществляется в той же
    последовательности, что и in vivо – отщепляется лидирующий полипептид,
    препроинсулин превращается в инсулин через стадии окислительного сульфитолиза с
    последующим восстановительным замыканием трех дисульфидных связей и
    ферментативным вычленением связывающего С-пептида. После ряда
    хромотографических очисток, включающих ионообменные, гелевые и ВЭЖХ, получают
    человеческий инсулин высокой чистоты и природной активности.
    Можно использовать
    штамм со встроенной в плазмиду нуклеотидной последовательностью,
    экспрессирующей гибридный белок, который состоит из линейного проинсулина и
    присоединенного к его N-концу через остаток метионина фрагмента белка А
    Staphylococcus aureus.
    Культивирование
    насыщенной биомассы клеток рекомбинантного штамма обеспечивает начало
    производства гибридного белка, выделение и последовательная трансформация
    которого in tube приводят к инсулину.
    Возможен и
    другой путь: получается в бактериальной системе экспрессии слитой
    рекомбинантный белок, состоящий из проинсулина человека и присоединенного к
    нему через остаток метионина полигистидинового “хвоста”. Его выделяют,
    используя хелатную хроматографию на колонках с Ni-агарозой из телец включения и
    расщепляли бромцианом.
    Выделенный
    белок является S-сульфонированным. Картирование и масс-спектрометрический
    анализ полученного проинсулина, очищенного ионнообменной хроматографией на
    анионите и ОФ (обращеннофазовой) ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной
    хроматографией), показывают наличие дисульфидных мостиков, соответствующих
    дисульфидным мостикам нативного проинсулина человека.
    В последнее
    время пристальное внимание уделяется упрощению процедуры получения
    рекомбинантного инсулина методами генной инженерии. Так, например, можно получить
    слитой белок, состоящий из лидерного пептида интерлейкина 2 присоединенного к
    N-концу проинсулина, через остаток лизина. Белок эффективно экспрессируется и
    локализуется в тельцах включения. После выделения белок расщепляется трипсином
    с получением инсулина и С-пептида.
    Полученные
    инсулин и С-пептид очищались ОФ ВЭЖХ. При создании слитых конструкций весьма
    существенным является соотношение масс белка носителя и целевого полипептида.
    С-пептиды соединяются по принципу “голова-хвост” с помощью
    аминокислотных спейсеров, несущих сайт рестрикции Sfi I и два остатка аргинина
    в начале и в конце спейсера для последующего расщепления белка трипсином. ВЭЖХ
    продуктов расщепления показывает, что отщепление С-пептида проходит
    количественно, а это позволяет использовать способ мультимерных синтетических
    генов для получения целевых полипептидов в промышленном масштабе.
    Заключение
    Сахарный
    диабет – хроническое заболевание, обусловленное абсолютной или относительной
    недостаточностью инсулина. Оно характеризующееся глубоким нарушением обмена
    углеводов с гипергликемией и глюкозурией, а также другими нарушениями обмена
    веществ в результате воздействия ряда генетических и внешних факторов.
    Инсулин до
    настоящего времени служит радикальным, а в большинстве случаев единственным
    средством для поддержания жизни и трудоспособности больных сахарным диабетом.
    До получения и внедрения инсулина в клинику в 1922-1923 гг. больных сахарным
    диабетом I типа ждал летальный исход в течение одного-двух лет с начала
    заболевания, несмотря на применение самых изнурительных диет. Больные сахарным
    диабетом I типа нуждаются в пожизненной заместительной терапии препаратами
    инсулина. Прекращение в силу тех или иных причин регулярного введения инсулина
    ведет к быстрому развитию осложнений и скорой гибели больного.
    В настоящее
    время сахарный диабет по распространенности находится на 3-м месте после
    сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний. По данным Всемирной
    организации здравоохранения, распространенность сахарного диабета среди
    взрослого населения в большинстве регионов мира составляет 2-5 % и имеется
    тенденция увеличения количества больных почти в два раза каждые 15 лет.
    Несмотря на очевидный прогресс в области здравоохранения, численность
    инсулинзависимых больных увеличивается с каждым годом и на текущий момент
    только в России составляет около 2 миллионов человек.
    Создание
    препаратов отечественного генно-инженерного инсулина человека открывает новые
    возможности решения многих проблем диабетологии России для спасения жизни
    миллионов людей, страдающих сахарным диабетом.
    Список литературы
    1.
    Биотехнология:
    Учебное пособие для ВУЗов /Под ред. Н.С. Егорова, В.Д. Самуилова.- М.: Высшая
    школа, 1987, стр. 15-25.
    2.
    Генно-инженерный
    инсулин человека. Повышение эффективности хроматографического разделения при
    использовании принципа бифункциональности. / Романчиков А.Б., Якимов С.А.,
    Клюшниченко В.Е., Арутунян А.М., Вульфсон А.Н. // Биоограническая Химия, 1997 –
    23, № 2
    3.
    Глик
    Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. М.: Мир,
    2002.
    4.
    Егоров
    Н. С., Самуилов В. Д. Современные методы создания промышленных штаммов
    микроорганизмов // Биотехнология. Кн. 2. М.: Высшая школа, 1988. 208 с.
    5.
    Иммобилизация
    трипсина и карбоксипептидазы В на модифицированных кремнеземах и их применение
    в превращении рекомбинантного проинсулина человека в инсулин. / Кудрявцева
    Н.Е., Жигис Л.С., Зубов В.П., Вульфсон А.И., Мальцев К.В., Румш Л.Д. //
    Хим.-фармац. ж., 1995 – 29, № 1 стр. 61 – 64.
    6.
    Молекулярная
    биология. Структура и функции белков./ Степанов В. М.// Москва, Высшая школа,
    1996.
    7.
    Основы
    фармацевтической биотехнологии: Учебное пособие / Т.П. Прищеп, В.С. Чучалин,
    К.Л. Зайков, Л.К. Михалева. – Ростов-на-Дону.: Феникс; Томск: Издательство НТЛ,
    2006.
    8.
    Синтез
    фрагментов инсулина и изучение их физико-химических и иммунологических свойств.
    / Панин Л.Е., Тузиков Ф.В., Потеряева О.Н., Максютов А.З., Тузикова Н.А., Сабиров
    А.Н. // Биоорганическая Химия, 1997 – 23, № 12 стр. 953 – 960.

Добавить ответ

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *