Мутация гена jak2 v617f что это значит?

15 ответов на вопрос “Мутация гена jak2 v617f что это значит?”

  1. kingdom_of joker Ответить

    В дальнейшем начали появляться сообщения об использовании количественного измерения доли клеток с мутацией JAK2V617F при оценке молекулярного ответа на лечение [12, 16, 18].
    В 2009 г. European LeukemiaNet [2] предложены новые критерии молекулярного ответа на лечение ЭТ и ИП, согласно которым различают три типа молекулярного ответа (полный, частичный и отсутствие). Полный молекулярный ответ – снижение количества клеток с мутацией до недетектируемого уровня. Частичный молекулярный ответ: 1) уменьшение более чем на 50% количества клеток с мутантным аллелем при первоначальном уровне мутации более 50%; 2) уменьшение более чем на 25% количества клеток с мутантным аллелем при первоначальном уровне мутации менее 50%. Отсутствие молекулярного ответа – это любой ответ, неудовлетворяющий критериям частичного молекулярного ответа.
    В том же в 2009 г. были опубликованы [20] результаты сравнительного изучения эффективности различных методов количественной оценки JAK2V617F мутации, проводимых в европейских странах. Работа шла в два этапа в 16 исследовательских центрах Европы с использованием различных методов (Tagman qPCR, TagMan AS-qPCR, AS-PCR и DNA sequencing) и стандартов (клеточная линия HEL, ДНК пациентов, плазмиды с фрагментом гена JAK2V617F, клеточная линия UKE1). На первом этапе проводили количественную оценку JAK2V617F – мутации в 29 образцах (26 положительных и 3 отрицательных) ДНК пациентов с ЭТ и ИП. На следующем этапе с целью стандартизации применяемых методов и стандартов в исследование были включены ДНК больных, плазмиды, клеточные линии (HEL/Karpas 199 и UKE1). Из клеток UKE1 и лейкоцитов здоровых лиц были получены пулы клеток (с содержанием клеток UKE1: 100, 75, 50, 25, 10 и 1%) для дальнейшего выделения с вышеуказанным содержанием количества JAK2V617F-копий ДНК UKE1. Из всех проанализированных методов количественной оценки мутации JAK2V617F наиболее высокоспецифичным и высокочувствительным (0,2%) оказался метод Tagman As-qpcR с обратными аллельспецифичными праймерами и одним мисматч-нуклеотидом. Сиквенсовые методы по специфичности (1 ложноположительный и 6 ложноотрицательных
    результатов в двух центрах) и чувствительности (5%) значительно уступали TagMan AS-qPCR.
    Учитывая назревшую клинико-диагностическую необходимость количественной оценки мутации JAK2V617F у наших больных, а также высокую стоимость импортных ПЦР тест-систем для таких целей (Ipsogen), мы решили разработать собственную тест-систему ПЦР в реальном времени (РВ) для количественной оценки мутации V617F гена JAK2.
    Материалы и методы. Всего обследовано 244 пациента с направительным диагнозом ИП (n-31), ИМФ (n-59) и ЭТ (n-54), а также 100 с различными миелопролиферативными нарушениями симптоматического характера в возрасте от 5 до 80 лет.
    В качестве положительного контроля использовали ДНК клеточной линии UKE1. Клеточная линия UKE1 (предоставлены проф. В. Fehse из Uniclinik Eppendorf, Германия) представляет собой культуру клеток с гомозиготной мутацией V617F гена JAK2.
    Лейкемические клетки UKE1 получены от пациента с миелодиспластическим синдромом, и по данным FISH, ПЦР и иммуногистологических исследований для них характерны эндотелиальные, гематопоэтические и лейкемогенные свойства [7]. Морфологически эти клетки могут быть подразделены на большие, прикрепляющиеся к стенкам флакона клетки с видными вакуолями, и меньшие, не прикрепляющиеся. Некоторые клетки напоминают зрелые гранулоциты и способны дифференцироваться спонтанно по миелоидной линии (рис. 1; с изменениями [7]).
    Клетки UKE1 выращивали в С02-инкубаторе (5% CO2) в модифицированной среде (Iscove modified Dulbecco medium, IMDM) Dulbecco, содержащей эмбриональные 10% сыворотки теленка (fetal calf serum, FCS) и лошади, а также 1 мМ гидрокортизона.
    Отрицательным контролем служила ДНК, выделенная из ядерных клеток периферической крови донора.
    Выделение ДНК. Взвесь ядерных клеток крови была получена методом лизиса эритроцитов. Далее к взвеси клеток добавляли 600 мкл лизирующего буфера (Tris-Cl (pH 7,6) 1М – 100 мл, EDTA (pH 8,0) 0,5 М – 80 мл, NaCl 1М – 50 мл, SDS 10% – 20 мл, вода 750 мл) и полученную смесь доводили до гомогенного состояния. Осаждение белков осуществляли добавлением 200 мкл насыщенного раствора NH4CL и центрифугированием 10 мин при 13 400 об/мин. Образовавшийся супернатант (300 мкл) переносили в заранее приготовленную пробирку, содержащую 300 мкл изопропанола, и для осаждения ДНК центрифугировали 10 мин при 12 000 g. Осадок ДНК дважды промывали 70% этиловым спиртом (500 мкл), высушивали при комнатной температуре с открытой крышкой и растворяли в 200 мкл деионизированной во-
    Рис. 2. Электрофореграмма. K- – отрицательный контроль (вода); Р1 и Р2 – ДНК больных ИП; D и D2 – ДНК доноров; UKE1 ДНК из клеток UKE1; UKEl+Dj – смесь (1:5) ДНК UKEI и донора; MW (molecular weight) – маркер молекулярной массы.
    дой. Концентрацию ДНК определяли на спектрофотометре Beckman DU-64.
    Real-time TaqMan PCR. Количественную ПЦР в реальном времени проводили с использованием набора реактивов и ам-плификатора АНК-32 (“Синтол”, Россия). ПЦР осуществляли в смеси растворов с конечным объемом 25 мкл: ПЦР буфер 10х 2,5 мкл; dNTP (“Promega”) 50x 0,5 мкл; 2 пары праймеров по 7,5 пкмоль каждый; 2 флюоресцентные ПЦР зонды по 3 пкмоль; ДНК Taq полимеразы 5 ед/мкл (“Синтол”, Россия) 0,25 мкл; ДНК матрица 125 нг Амплификации проводили в следующем режиме: при 95°С 300 с, 50 циклов при 95°С 15 с и при 60°С 60 с. Использовали олигонуклеотиды: Fw primer (общий) 5′-CTTTCTTTGAAGCAGCAAGTATGA-3′;Probe (зонд) 6-FAM-TGAGCAAGCTTTCTCACAAGCATTTGGTTT-TAMRA; Wd_R primer 5′-GTAGTTTTACTTACTCTCGTC-TCCACAtAC-3′; Mt_R primer 5′-GTAGTTTTACTTACTCT-CGTCTCCACAtAA-3′.
    Для расчета количества копий ДНК использовали ген ин-

  2. day TV Ответить

    соматическая мутация в положении 1849 G>T гена JAK2 (Янусовой киназы) приводит к изменениям в стволовой кроветворной клетке и нарушению процесса образования клеток крови.

    JAK2-мутация положительна при следующих заболеваниях:

    истинная полицитемия 99%
    эссенциальная тромбоцитемия 55%
    идиопатический миелофиброз 65%
    хронический миелолейкоз
    миелодиспластический синдром с кольцевидными сидеробластами
    Анализ на JAK2 мутацию применяется для диагностики миелопролиферативных заболеваний, исключения вторичных причин повышенного уровня тромбоцитов (вторичной тромбоцитемии) и эритроцитов (вторичного эритроцитоза).

    Что такое JAK2?

    Ген JAK2 расположен на 9-й хромосоме (в положении 9p24) и кодирует протеиновую тирозинкиназу JAK2, которая, в свою очередь входит в группу янусовых протеинкиназ (JAK1, LAK2, JAK3, JAK4).
    JAK2 представлена во всех клетках тела, в том числе и клетках крови, где принимает участие в передаче сигнала активируя транскрипцию во многих клеточных процессах.
    Мутация JAK2 приводит к дерегуляции JAK-STAT и последующему аномальному накоплению онкопротеинов с фенотипическими чертами миелопролиферативных неоплазий.

    Миелопролиферативные заболевания

    Миелопролиферативные заболевания — группа заболеваний костного мозга, объединенных в вместе по признаку первичной мутации на уровне стволовой клетки крови. Характеризуется не контролируемым делением и созреванием одной или нескольких клеточных линий крови (эритроциты, лейкоциты, тромбоциты) и постепенным угнетением нормального кроветворения.
    Слово «миелопролиферативный» значит, что костный мозг (на греческом миелос) пролиферирует, вырабатывает в избыточном количестве клетки крови. Нарушение возникает на уровне плюрипотентной стволовой клетки (плюрипотентный — значит может развиваться в любую сторону — как в лейкоциты, так и эритроциты или тромбоциты).
    Например, при истинной полицитемии увеличивается число прежде всего эритроцитов, при тромбоцитемии — тромбоцитов, первичном миелофиброзе — также тромбоцитов, а при хроническом миелолейкозе — лейкоцитов (гранулоцитов).

    Частота миеопролиферативных заболеваний довольно большая, ежегодно заболевают 6-9 человека из 100 тысяч. Чаще болеют люди старшего возраста, после 50-ти лет.

  3. phoe6 Ответить

    Миелопролиферативные заболевания — группа заболеваний костного мозга, объединенных в вместе по признаку первичной мутации на уровне стволовой клетки крови. Характеризуется не контролируемым делением и созреванием одной или нескольких клеточных линий крови (эритроциты, лейкоциты, тромбоциты) и постепенным угнетением нормального кроветворения.
    Слово «миелопролиферативный» значит, что костный мозг (на греческом миелос) пролиферирует — вырабатывает в избыточном количестве клетки крови. Нарушение на уровне плюрипотентной стволовой клетки (плюрипотентный — значит может развиваться в любую сторону — как в лейкоциты, так и эритроциты или тромбоциты).
    Например, при истинной полицитемии увеличивается число прежде всего эритроцитов, при тромбоцитемии — тромбоцитов, первичном миелофиброзе — также тромбоцитов, а при хроническом миелолейкозе — лейкоцитов (гранулоцитов).

    Частота миеопролиферативных заболеваний довольно большая, ежегодно заболевают 6-9 человек из 100 тысяч. Чаще болеют люди старшего возраста, после 50-ти лет.

    Симптомы

    общая слабость
    снижение веса и отсутствие аппетита
    повышенная потливость, особенно в ночные часы
    тяжесть в правом/левом подреберье

    Показания

    повышенное/сниженное число тромбоцитов,эритроцитов, лейкоцитов в крови
    анемия — снижение уровня гемоглобина в крови неясного происхождения

  4. hithman Ответить

    ?УЧЕНЫЕ ЗАПИСКИ СПбГМУ ИМ. АКАД. И. П. ПАВЛОВА • ТОМ XV • №4 • 2008
    © Коллектив авторов, 2008 г
    УДК 616.155.392.8-036.12-008.434.59
    И. Ю. Сабурова, Я. С. Оникичук, И. И. Зотова, Г. Н. Салотуб, М. И. Зарайский
    ОПРЕДЕЛЕНИЕ МУТАЦИИ
    В ГЕНЕ Jak2 У ПАЦИЕНТОВ С ХРОНИЧЕСКИМИ МИЕЛОПРОЛИФЕРАТИВНЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ
    Кафедра клинической лабораторной диагностики с курсом молекулярной медицины, кафедра факультетской терапии, 31 поликлиника Санкт-Петербургского государственного медицинского университета имени академика И. П. Павлова
    ВВЕДЕНИЕ
    Хронические миелопролиферативные заболевания (МПЗ) представляют собой группу клональных нарушений гемопоэтической стволовой клетки, характеризующихся пролиферацией одной или более миелоидных линий в косном мозге и повышенным количеством зрелых и незрелых клеточных форм в крови [1]. Согласно классификации ВОЗ, МПЗ включают в себя истинную полицитэмию, эссенциальную тромбоцитэмию, идеопатический миело-фиброз и хронический миелолейкоз, плюс редкие типы патологии, такие как нейтрофильная лейкемия, гиперэози-нофильный синдром и хроническая эозинофильная лейкемия [4]. Данные патологии имеют ряд схожих клинических признаков: гиперклеточность костного мозга, увеличение количества зрелых клеток одной или нескольких линий в крови, тромбозы, кровотечения, трансформация в острый миелоидный лейкоз или миелофиброз. Диагностика этих патологий сложна и часто основывается на критериях исключения [2]. Поэтому поиск специфических признаков, позволяющих провести дифференциальную диагностику, является чрезвычайно актуальным.
    В 1960 г. был открыт первый молекулярный маркер хронического миелолейкоза – Всг/АЫ, транслокация ^9;22). Это позволило не только разработать высокоспецифичный метод диагностики, но и развить таргетную терапию и разработать методики мониторинга минимальной остаточной болезни. С тех пор перечень молекулярных маркеров, ассоциированных с гематологической патологией, постоянно расширяется.
    Одним из наиболее диагностически значимых критериев для МПЗ является наличие мутации V617F в гене Jak2 [6]. Мутация V617F в гене Jak2 определяется в 9095 % случаев истинной полицитэмии, 50-70 % случаев эссенциальной тромбоцитэмии и 40-50 % случаев мие-лофиброза [3]. Ген Jak2 экспрессирован в ранних предшественниках гемопоэза и кодирует нерецепторную ти-розинкиназу, участвующую в передаче сигнала от рецепторов цитокинов и факторов роста к ядру клетки. Мутация
    V617F вызывает конститутивную активацию рецептора без участия лиганда, что приводит к активации пролиферации клетки и блокаде процессов апоптоза.
    Таким образом, основной целью данного исследования явилась разработка простого метода детекции мутации V617F в гене Jak2, пригодной как для первичной диагностики данных патологий, так и для полуколичественной оценки минимальной остаточной болезни на фоне терапии.
    МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
    Характеристика групп пациентов
    В исследование были включены 58 пациентов, обследованных на базе Центра лабораторной диагностики СПбГМУ им. акад. И. П. Павлова. Из них 6 человек обследовались с предварительным диагнозом «идеопатичес-кий миелофиброз», 8 человек – с диагнозом «истинная полицитэмия», 7 человек – с диагнозом «эссенциальная тромбоцитэмия» и 35 человек с диагнозом «невирифи-цированная хроническая миелопролиферация». Средний возраст пациентов составил 55 лет. До обследования пациенты не получали специфической терапии. В качестве группы сравнения использовались 10 стандартных доноров крови.

  5. Axeworm Ответить

    The concomitant occurrence of JAK2V617F mutation and BCR/ABL transcript with phenotypic expression – an overlapping myeloproliferative disorder or two distinct diseases? – case report
    Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3624642/
    Сопутствующее возникновение мутации JAK2617F и транслокация BCR / ABL — редкое событие. Неясно, является ли это результатом клональной эволюции или раздельного появления двух клонов, и если это может привести к прогрессированию на более агрессивную фазу заболевания. Мы представляем случай, когда 61-летний мужчина диагностирован и лечится от полицитемии вера в течение 7 лет, что превратилось в хронический миелоидный лейкоз BCR / ABL-положительный и с мутантным клоном JAK2617F, который стал доминирующим после эффективного лечения иматинибом.
    Сокращения: ВОЗ — Всемирная организация здравоохранения; ХМЛ — хронический миелоидный лейкоз; MPN — миелопролиферативные новообразования; ПЦР-полимеризованная цепная реакция; Ингибиторы TKI — тирозинкиназы; PV — полицитемия vera; ET — существенная тромбоцитемия; PMF — первичный миелофиброз; ESR — скорость оседания эритроцитов; WBC — количество лейкоцитов; LDH — лактикодегидрогеназа; АЛП — щелочной лейкоцитарный фосфатиз
    Миелопролиферативные расстройства представляют собой гетерогенную группу заболеваний, которые включают полицитемию, первичный миелофиброз, существенную тромбоцитемию. Поскольку обнаружение транслокации BCR / ABL и специфического цитогенетического маркера, хромосомы Филадельфии, было получено из транслокации t (9; 22) (q34; q11), хроническая миелоидная лейкемия — это отдельная сущность и отдельное заболевание. Это также модель для успешной целенаправленной терапии из-за специфического эффекта Иматиниба против активности тирозинкиназы продукта в отношении слитого гена BCR / ABL. Классификация ВОЗ опухолей гематопоэтических и лимфоидных тканей включает полицитемию, первичный миелофиброз, существенную тромбоцитемию в группе миелопролиферативных новообразований (МПН) [1]. Все эти заболевания вызваны клональными повреждениями и трансформацией гемопоэтических стволовых клеток, и из-за необычного, затронутого гематопоэза они могут делиться клиническими признаками или симптомами перекрытия во время их эволюции и прогрессирования до более агрессивных моделей, таких как острый лейкоз.
    Необходимые мутации генов необходимы, но не достаточные условия для достижения злокачественного фенотипа. Их обнаружение способствует определению конкретного заболевания или контролю эволюции и ответной реакции на лечение. В клинической практике анализ ПЦР в реальном времени доказал свою полезность для прогнозирования ответа на терапию TKI в ХМЛ. Среди мутаций, связанных с MPN, JAK2V617F является наиболее распространенным, основанным примерно на 95% случаев PV, 50-65% случаев ET и PMF и до 50% случаев анемии с кольчатыми сидеробластами и тромбоцитозом. Мутация JAK2V617F также присутствует в 3-9% случаев хронического миеломоноцитарного лейкоза [2]. Существует сильная корреляция между обнаружением мутации JAK2 и диагностикой PV, как в случае транслокации CML и BCR / ABL. Мутация JAK2 приводит к активации сигнального пути JAK / STAT (преобразователь сигнала и активатор транскрипции), что приводит к клеточной пролиферации, устойчивости к апоптозу и прогрессированию к открытым MPN. В некоторых случаях два и более мутаций были описаны у одного и того же пациента, но фенотипическое выражение может быть немым. Сопутствующая мутация JAK2V617F и транслокация BCR / ABL у одного и того же человека необычны. Были описаны случаи ХМЛ на поздних стадиях и сопутствующие мутации как TET2, CBL, ASXL1, IDH1 в качестве сигналов для прогрессивной эволюции [3]. В переписке, опубликованной в Blood, no118, 2011, группа итальянских авторов проанализировала частоту сопутствующего двойного мутированного фенотипа JAK2V617F и BCR / ABL положительного на большой когорте из 314 пациентов с диагнозом типичного ХМЛ и обнаружила 8 случаев хронической фазы Пациентов с ХМЛ, которые содержали мутацию JAK2V617F и транслокацию BCR / ABL [3,4].
    Мы сообщаем о случае 61-летнего мужчины, диагностированного в 2003 году в клинике гематологии Fundeni с полицитемией верой на основе клинических и биологических стандартных критериев [5]. Клинические и лабораторные данные представлены в таблице 1.
    Лабораторные данные при диагностике состояния PV
    Интересно, что у пациента был сынок, диагностированный 5 лет назад, с ходгкинской лимфомой (смешанная клеточность) на стадии IIIB, успешно лечившейся и живой, при полной ремиссии во время этого отчета и брата, диагностированного с анапластической В-лимфомой IVB стадии, с пагубной эволюцией , Во время диагностики по техническим причинам мы не можем выполнять скрининг на мутацию JAK2V617F. Его лечили флеботомиями и гидроксимочевиной в течение 7 лет с хорошим клиническим и гематологическим состоянием. В октябре 2010 года он снова приехал в нашу клинику с бледностью, одышкой при нагрузке, гепатоспленомегалией (на 5 сантиметров ниже береговой разницы) и гематологическими тестами, очень наводящими на мысль о хроническом миелоидном лейкозе. Результаты лабораторных исследований представлены в таблице 2.
    Лабораторные данные при диагностике состояния CML
    Анализ FISH проводили на межфазных клетках с использованием двухцветного зонда BCR / ABL, предоставленного Cytocell, Cambridge, UK (фиг.1A и 1B).
    Рис. 1А. Схематическое изображение зондов, предоставленных Cytocell, Cambridge, UK;
    Рисунок 1B Нормальная ячейка с двумя четко разделенными зелеными (зонд BCR) и сигналами красного (ABL зонда) (слева); Ph-позитивная ячейка с одним красным сигналом, одним зеленым сигналом и двумя желтыми сигналами (слияние зондов ABL и BCR на Ph-хромосоме)
    Образец крови непосредственно инкубировали в гипотоническом растворе KCl (0,075 М), а затем фиксировали (метанол: уксусная кислота — 3: 1). После приготовления слайдов слайды выдерживали путем инкубации в течение ночи при 37 ° С. Анализ FISH культивируемого образца BM проводили с использованием слайдов, полученных стандартным протоколом для цитогенетического исследования. Слайды обезвоживали спиртовой серии. Совместную денатурацию проводили в течение 2 минут при 75 ° C с последующей гибридизацией в течение ночи при 37 ° C. После гибридизации в течение ночи слайды промывали в 0,4X SSC при 73 ° C в течение 2 минут и промывали в 2 ? SSC. Оценка сигналов FISH проводилась с использованием флуоресцентного микроскопа (AxioImager, Zeiss, Германия). Было оценено 200 межфазных ядер.
    Также был выполнен обычный кариотипирование (рис.2).
    Кариотип 46, XY, t (9; 22) (q34; q11)
    Образец костного мозга культивировали с использованием протокола ночной и синхронной культуры и обрабатывали обычными цитогенетическими процедурами с использованием GTG-обвязки [7]. Было проанализировано 20 метафаз, и кариотип был описан в соответствии с ISCN 2009 [8].
    Молекулярный анализ для количественного определения транскрипта BCR / ABL проводился на периферической крови на приборе ABI 7700. ПЦР в реальном времени проводили с использованием специфических праймеров: для основных BCR / ABL (p210) и минорных (p190) и контрольного гена ABL (Gabert et al., Leukemia, 2003). Результат был положительным для крупного транскрипта BCR / ABL (p210) на высоком уровне (100%). Дополнительные тесты для ETV6 / ABL и FIP1L1PDGFA (del4q12) были отрицательными. В том же образце мы выполнили тест на мутацию JAK2V617F.
    Обнаружение мутации jak2V617F проводили в соответствии с методом ARMS (Amplification refractory mutation system), описанным Jones и col. в Blood, vol. 6, no 6, сентябрь 2005 г., и результат был отрицательным [9]. Биопсия костного мозга подтвердила диагноз хронической фазы хронического миелоидного лейкоза.
    После 6 месяцев циторедуктивного лечения гидроксимочевиной пациент начал лечение иматинибом 400 мг / сут с полным гематологическим ответом и полным цитогенетическим и молекулярным ответом, оцененным согласно ELN Reccomandations через 6, 12 и 18 месяцев. Оценка FISH для t (9; 22) (q34; q11) через 6 месяцев была отрицательной, а цитогенетическое исследование (20 анализируемых метафаз) через 12 месяцев было нормальным, без филадельфийской хромосомы. Через 18 месяцев после начала транскрипта Иматиниба BCR / ABL не было обнаружено. В течение второго года после диагностики ХМЛ пациент оценивался ежемесячно для гемограмм, и мы наблюдали переход к полицитемическому фенотипу с увеличением гематокрита и гемоглобина, без признаков клональной эволюции для ХМЛ: уровень транскрипта BCR / ABL остается неопределяемым при 24 месяца, но была обнаружена мутация JAK2V617F в гомозиготном состоянии (рис.3).
    Мутация JAK2V617F, идентифицированная в гомозиготном состоянии у нашего пациента (P2); M-отрицательный контроль;
    M + — положительный контроль в гетерозиготном (Mhet) и в гомозиготном (Mhom) состоянии
    Genomic ADN получали с использованием стандартных процедур очистки из периферической крови с помощью коммерческого набора QIAGEN, UK. Спектрофотометрическое измерение проводили с помощью гена nanodrop ACT, США. в методике использовались две пары праймеров (тетрапримеров), которые амплифицировали в той же реакции контрольный фрагмент и фрагменты, соответствующие мутации V617F и дикой последовательности (праймеры из Eurogentec, фермент: HotStar Taq полимераза Oiagen, UK, 50bpDNA-лестница Invitrogen, UK) , Ампликон были контрольным фрагментом (463bp) и фрагментами, соответствующими мутации V617F (279bp) и дикой последовательностью (229bp); они обнаруживаются посредством электрофореза в 3% агарозном геле, окрашиваются бромидом этилия и визуализируются с помощью ультрафиолетового транслюминатора. Все образцы имеют контроль: положительный (содержащий мутированный аллель) и отрицательный (содержащий дикий аллель). Метод имеет внутреннюю и внешнюю проверку.
    Флеботомии были добавлены в лечении пациента. В настоящее время он все еще находится на Иматинибе, в хорошем клиническом и гематологическом состоянии, полной цитогенетической ремиссии и необнаружимом уровне транскрипта BCR / ABL.
    Описанный случай иллюстрирует эволюцию и клиническое выражение двух генетических аномалий, связанных с двумя различными миелопролиферативными заболеваниями. Возникновение одной мутации предсказуемо для геномной нестабильности [6]. Вероятно, мутация JAK2V617F была первой, поскольку диагноз PV и предшествует появлению нового клона с транслокацией BCR (22q11.23) / ABL (9q34).
    Возможно, возникает вопрос: существует ли в этом случае мутагенная роль гидроксимочевины? Другая гипотеза может заключаться в том, что субклон BCR / ABL мутантной стволовой клетки появился из предыдущего мутантного клона JAK2V617F. Во время эволюции появились фенотипические выражения; когда лечение Иматинибом снизило нагрузку на BCR / ABL, мутированный клон JAK2V617F, менее подверженный влиянию, появился и стал доминирующим. Этот случай иллюстрирует важность проведения молекулярного анализа при миелопролиферативных заболеваниях еще более часто, когда фенотипическое выражение перекрывается. Фенотипическая гетерогенность является результатом накопления ранее существовавшего «молчаливого» мутированного клона или последующих генетических событий с геномной нестабильностью может привести к другой аномалии.
    Подтверждения:
    Дидона Василач — Лаборатория цитологии, Клинический институт Фундени
    Лаборатория Камелии Добреи-Гематопатологии, Клинический институт Фундени
    Думитру Жардан — для рассмотрения рукописи
    Раскрытие информации: авторы не заявляют о раскрытии информации
    Все авторы имеют равный вклад.

  6. WYWAJIG Ответить

    Малые 1. КМ с гиперклеточно-стью по возрасту и трехлинейный рост (панмие- лоз). 2. Субнормальный уровень сывороточного ЭПО. 3. Рост ЭЭК — 1. Лейкоэритро-бластоз. 2. Повышение активности сывороточной ЛДГ. 3. Анемия. 4. Спленомегалия (пальпируемая)
    Диагностические сочетания Основные критерии + 1 малый критерий или первый основной критерий + 2 малых критерия Все 4 критерия должны присутствовать Все 3 основных критерия + 2 малых критерия
    При появлении мутации ]ак2 (V617F или в эк-зоне 12) эти сигналы активируются автономно, независимо от связывания цитокина со своим рецептором [3, 4].
    Открытие мутации ]ак2 V617F значительно улучшает наше понимание патогенеза ИП, ЭТ и ПМФ, но этиология ЭТ и ПМФ без мутации ]ак2 V617F остается неясной. Известно, что большинство пациентов с ЭТ и ПМФ без мутации ]ак2 V617F имеют: тем не менее клональный гранулоцитопоэз [5].
    Среди «классических» ХМПЗ ИП и ЭТ — относительно безобидные болезни, которые приводят к небольшому сокращению продолжительности жизни по сравнению с контрольной популяцией. Однако у большинства пациентов в течение болезни возникает связанное с ней то или иное тяжелое и опасное осложнение. И, наоборот, ПМФ в большинстве случаев имеет тяжелое течение со значительно укороченным сроком выживания. У трех рассматриваемых клинических единиц есть несколько общих свойств, например: происхождение из мультипо-тентной гемопоэтической стволовой клетки, относительно нормальное созревание клеток и значительное сходство клинических проявлений. ПМФ может иметь собственные особые проявления, а для ИП и ЭТ характерна эволюция в постполицитемиче-ский и посттромбоцитемический миелофиброз (или реже один в другой) и способность заканчиваться острым миелобластным лейкозом [6].
    Опубликовано предложение пересмотреть диагностические критерии Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) по ХМПЗ [7]. Присутствие мутации ]ак2 V617F или других мутаций ]ак2, включая мутации в экзоне 12, теперь рассматриваются как главные критерии для диагноза
    ХМПЗ. Сейчас молекулярное исследование входит в диагностические критерии ВОЗ 2008 г. [1], а тесты на наличие мутаций ]ак2 стали стандартным методом диагностики ХМПЗ [8, 9]. Показано, что выявление одной из этих мутаций, несомненно, устанавливает наличие клонального ХМПЗ и исключает возможность реактивного эритроцитоза, тромбоцитоза или миелофиброза. К сожалению, они не помогают дифференцировать разные формы ХМПЗ (табл. 2).
    Наиболее часто встречаемые осложнения ХМПЗ — это тромбозы, спленомегалия, гипоклеточность костного мозга и трансформация в острый лейкоз [10]. Тромбозы могут наблюдаться как за несколько лет до постановки диагноза, так и после него. Сорок процентов пациентов с портальными венозными тромбозами являются носителями мутации ]ак2 V617F, поэтому этот диагностический тест необходим для этих состояний [11, 12].
    За период с ноября 2013 по апрель 2014 г. в ГАУЗ «РКБ» МЗ РТ нами было проведено 46 исследований на ]ак2 мутацию пациентов с подозрением на ХМПЗ. Средний возраст больных — 52±25 лет. Мужчины — 17 человек, женщины — 29 человек. В 37 случаях ]ак2 мутация была обнаружена.
    Диагноз истинной полицитемии был установлен у 29 человек, первичного миелофиброза — у 3 человек, эссенциальная тромбоцитемия — у 5 человек.
    Из всех пациентов троим была проведена сплен-эктомия за несколько лет до установки диагноза вследствие развития тромбоза селезеночной вены.
    В настоящее время исследование на наличие мутации ]ак2 V6l7F — необходимое условие для установления правильного диагноза и определения дальнейшей тактики ведения пациента.
    ЛИТЕРАТУРА
    1. Tefferi A., Vardiman J.W. Classification and of myeloproliferative neoplasms: Tye 2008 World Health Organization criteria and point-of care diagnostic algotryms // Leukemia. — 2008. — Vol. 22. — Р. 14-22.
    2. Kaushansky K. The chronic myeloproliferative disorders and mutation of Jak2: Dameshek’s 54 year old speculation comes of age // Best Pract. Res. Clin. Haematol. — 2007. — 20. — Р. 5-12.

  7. silence death Ответить

    Полиморфизм Val617Phe
    Физиология и генетика. JAK – тирозин-киназы, фосфорилирующие STAT-факторы (Janus kinase, названы так благодаря присутствию в одной молекуле двух киназных доменов) ассоциированы с рецепторами цитокинов, но неактивны пока рецепторы не агрегируют под действием цитокинов (аналогично рецепторам факторов роста). После агрегации происходит активация Jak за счет их трансфосфорилирования. Активированные Jak фосфорилируют множество тирозинов в цитоплазматической части рецепторов. К этим фосфотирозинам присоединяются молекулы белков, известных под общим названием белки STAT (signal transducers and activators of transcription). Белки STAT димеризуются и проникают в ядро. Там они сами или с участием других белковых факторов индуцируют транскрипцию тех или иных генов.
    Миелопролиферативные заболевания (МПЗ) – заболевания, характеризующиеся избыточной пролиферацией (выработкой клеток) одного или нескольких ростков кроветворения. Нарушения возникают на уровне стволовых клеток, вследствие чего может развиваться эритремия, сублейкемический миелоз, тромбоцитемия и хронический миелолейкоз.
    Показания к анализу
    • Установка или подтверждение диагноза истинной полицитемии, эссенциальной тромбоцитемии или идиопатического миелофиброза.
    • Дифференциальная диагностика истинной полицитемии и вторичного эритроцитоза.
    • Дифференциальная диагностика эссенциальной тромбоцитемии и реактивного тромбоцитоза.
    • Определение риска развития тромбозов.
    • Определение риска прерывания беременности.
    • Дополнительная дифференциальная диагностика идиопатического миелофиброза и атипичных форм МПЗ.
    • Дополнение к цитогенетическому и гистологическому исследованию костного мозга.
    Клинические данные. Недавние исследования обнаружили связь мутации V617F в гене JAK2 с классическими bcr/abl-негативными МПЗ: истинной полицитемией (болезнь Вакеза), эссенциальной тромбоцитемией (ЭТ) и идиопатическим миелофиброзом (ИМ). Кроме того, данная мутация в редких случаях встречается при атипичных МПЗ и миелодиспластических синдромах.
    Соматическая мутация V617F приводит к усилению сигнала от JAK2, ведущую к избыточной пролиферации того или иного ростка клеток. В исследовании E Joanna Baxter et al. [15781101] было продемонстрировано, что мутация V617F встречается в 97% при истинной полицитемии, в 57% при эссенциальной тромбоцитемии и в 50% при идиопатическом миелофиброзе.
    Полученные результаты согласуются с исследованиями, проведенными другими группами авторов: 65-97% при истинной полицитемии, 23-57% при эссенциальной тромбоцитемии и 35-95% при идиопатическом миелофиброзе.
    Peter J Campbell et al. [16325696] проанализировал взаимосвязь полиморфизма V617F с различными показателями крови у пациентов с эссенциальной тромбоцитемией. В работе приняли участие 806 пациентов. Авторы отметили увеличение уровня гемоглобина (в среднем на 9.6 г/л; 95% CI, 7.6–11.6 г/л; Р=0.0001) и нейтрофилов (на 1.1×109/л; 95% CI, 0.7–1.5х109/л; Р=0.0001), а также уменьшение сывороточного эритропоэтина (на 13.8 Ед/л; 95% CI, 10.8–16.9 Ед/л; Р=0.0001) и ферритина (n=182; 58 против 91 г/л; Р=0.01) у пациентов с изучаемым полиморфизмом.
    Миелопролиферативные заболевания способствуют развитию венозных тромбозов. Так, Colaizzo D. et al. [17059429] проанализировали истории болезни 99 пациентов с тромбозами воротной (портальной) вены (ТВВ) и тромбозами мезентериальных сосудов. Мутация гена JAK2 V617F обнаружилась у 17 человек (17,2%). Ни у одного из этих пациентов не выявлялись врожденные факторы риска к тромбофилии. 7 из 17 больных с мутацией JAK2 V617F (43,8%) и еще 2 человека (2,4%) без мутации JAK2 V617F на момент первого эпизода венозного тромбоза имели диагноз МПЗ. За период наблюдения, который составил в среднем 41 месяц, еще у 3 пациентов с мутацией JAK2 V617F обнаружились миелопролиферативные процессы. Ученые пришли к выводу, что изучаемый полиморфизм является маркером венозных тромбозов, а также необходим для более тщательного обследования пациентов на предмет развития миелопролиферативных заболеваний.
    Интересное наблюдение представили Stefano et al. [17263783] Они определяли мутацию в гене JAK2 V617F у 139 взрослых больных (старше 18 лет) с или без хронического МПЗ с тромбозами печеночных вен (15 человек), внепеченочных ТВВ и/или мезентериальных вен (79 человек) и церебральных вен (45 человек). Только 19 пациентов полностью соответствовали критериям истинной полицитемии (8 человек) или эссенциальной тромбоцитемии (11 человек) на момент возникновения тромбоза: у 4 больных развился тромбоз печеночных вен, у 11 – ТВВ и/или тромбоз мезентериальных вен, у 4 больных – тромбоз церебральных вен. Мутация в гене JAK2 V617F обнаруживалась у 94,7% больных с хроническим МПЗ, у 21,5% больных с тромбозами абдоминальных сосудов без МПЗ и у 4,8% больных с тромбозами церебральных вен без МПЗ. Среди пациентов без МПЗ и без тромбофилий, но с неспровоцированным тромбозом, 29,4% имели тромбоз вен внутренних органов, 42,8% имели ТВВ – одновременно с присутствием мутации гена JAK2 V617F. Таким образом, даже при отсутствии признаков явного МПЗ значительная часть больных с ТВВ и тромбозами сосудов головного мозга несет мутацию JAK2 V617F и имеет высокий риск повторных тромбозов.
    Mercier et al. (2007) [17989398] исследовали наличие мутации V617F гена JAK2 у 3496 женщин в связи с риском невынашиваемости беременности. Исследователи обнаружили, что соматическая мутация в значительной степени ассоциирована с потерей плода «fetal loss» (OR=4.63; Р = 0.002) и потерей эмбриона «embryonic loss» (OR=7.20; Р = 0.009). Авторы отмечают, что риск выкидыша у исследованных женщин при наличии мутации увеличивался независимо от генотипов 1691A фактора Ляйдена и 20210A протромбина.
    Важное замечание: мутация V617F является соматической, т. е:
    1. Возникает у человека спонтанно, а не передается по наследству от родителей.
    2. Мутантный аллель выявляется в основном в виде гетерозиготного генотипа.
    3. Возможно возникновение мутации через несколько лет после проведения данного анализа, следовательно, при необходимости целесообразно повторное проведение анализа.

  8. Evgesh@ Ответить

    сч cv
    es
    cv cv
    ны в критерии для постановки диагноза эссенциаль-ной тромбоцитемии и ПМФ по критериям Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ, 2016) [31]. Кроме того, опубликован ряд работ, описывающих клинические изменения, характерные для каждого типа мутаций при ЭТ и ПМФ, однако сравнительный анализ международных данных выявляет некоторые различия между ними. В ряде исследований когорт пациентов с ЭТ и ПМФ показано, что носители мутации в гене CALR имеют более низкие уровни гемоглобина и лейкоцитов и более высокое содержание тромбоцитов по сравнению с группой больных, имеющих мутацию в гене JAK2 [19, 31—33]. При этом среди пациентов с мутацией CALR отмечена редкая встречаемость венозных тромбозов [22, 34—36]. Также выявлена более высокая частота фиброзной трансформации при ЭТ с мутацией в гене CALR [20, 34]. Однако некоторые исследователи не выявили существенных различий в развитии венозных тромбозов и риска фибротической трансформации [31, 32], а также в показателях общей выживаемости [32, 34] у пациентов с ЭТ в зависимости от наличия мутации CALR или JAK2. В одном из исследований не выявлено значимой связи между присутствием мутации CALR и клинико-лабораторными особенностями или стратификацией пациентов при ПМФ в соответствии со шкалой IPSS (International Scoring Prognostic System — Международная шкала оценки прогноза)
    [37]. Тем не менее при ЭТ и ПМФ подтверждается положительное влияние мутации гена CALR на выживаемость больных [19, 33].
    Кроме того, в ряде работ были выявлены различия в клинических и лабораторных особенностях пациентов, несущих разные типы мутаций CALR [38, 39]. Сравнительный анализ мутаций 1-го и 2-го типов в группе пациентов с ПМФ показал, что пациенты с мутациями 2-го типа относились к группе высокого риска (4 балла и более по системе стратификации DIPSS), имели выраженный лейкоцитоз и повышенное содержание бластных клеток в периферической крови по сравнению с пациентами, несущими мутации 1-го типа. Общая выживаемость пациентов с мутациями CALR 2-го типа и JAK-2 была значительно ниже выживаемости пациентов с мутациями 1-го типа
    [38]. Исследование когорты пациентов с ЭТ не выявило различий между вариантами мутаций CALR в уровне гемоглобина, количестве лейкоцитов и стратификацией пациентов в соответствии с классификацией по системе IPSS, а также в показателях общей выживаемости и риска возникновения тромботических осложнений, однако содержание тромбоцитов при мутациях 2-го типа CALR было значительно выше, чем при мутациях 1-го типа [39].
    Целью данного исследования стало выявление клинических особенностей у пациентов с ЭТ и ПМФ в зависимости от наличия мутаций генов JAK2V617F и CALR.
    Материалы и методы
    Проведено ретроспективное исследование пациентов, наблюдавшихся в ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр им. В.А. Алмазова» (НМИЦ им. В.А. Алмазова) Минздрава России (Санкт-Петербург), БУ «Республиканская клиническая больница» Минздрава Чувашии (Чебоксары), ГБУЗ «Иркутская ордена “Знак Почета” областная клиническая больница» (Иркутск), ФГБУН «Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства» (Киров). В исследование были включены 149 пациентов, у 76 из них диагностирован ЭТ (22 мужчины, 54 женщины), у 73 — ПМФ (30 мужчин, 43 женщины).
    Всеми пациентами было подписано информированное согласие на участие в исследовании. Данные собирались из медицинской документации, полученной в ходе амбулаторного консультирования пациентов с установленными диагнозами ПМФ и ЭТ.
    Диагноз устанавливался с учетом действующих рекомендаций ВОЗ (2008) [40], в дальнейшем пересматривался ретроспективно в соответствии с новыми критериями ВОЗ от 2016 г. [31]. Показатели гемограмм (уровень гемоглобина, тромбоцитов, лейкоцитов, количество бластных клеток) регистрировались на момент диагностики, учитывались клинические данные, размеры печени и селезенки, проводилась стратификация пациентов по группам риска в соответствии с системами IPSS и DIPSS [41, 42]. Исследование утверждено этическим комитетом ФГБУ «СЗФМИЦ им. В.А. Алмазова» Минздрава России.
    В клетках периферической крови больных проводили определение возможных генетических мутаций, встречающихся при данных нозологиях: CALR (с выделением 1-го и 2-го типов), MPL W515L/K, JAK2V617F. При получении отрицательных результатов на вышеуказанные мутации устанавливался «тройной негативный» статус (triple negative).
    Исследование образцов крови. Выделение ДНК проводили из 500 мкл крови с использованием набора реагентов FlexiGene DNA Kit (Qiagen, Германия) и в соответствии с инструкцией производителя. Концентрацию и чистоту ДНК оценивали с помощью прибора NanoDrop 1000 (Thermo Scientific, США).
    Для амплификации 9-го экзона гена CALR1 использовали пару специфических олигонуклеотидных праймеров CALR-Fи CALR-R [20]. Реакционная смесь содержала: 10Х Taq-буфера (Евроген, РФ), 50Х смесь dNTP (10 мМ каждого) (Евроген, РФ), 50Х Taq ДНК-полимеразы (Евроген, РФ), 0,4 мкМ праймера CALR-F, 0,4 мкМ праймера CALR-R и 100 нг ДНК, конечный объем реакционной смеси составил 25 мкл. Для проведения амплификации использовали прибор DNA Engine Dyad Thermal Cycler (Bio-Rad, США). Программа для амплификации включала: первичную денатурацию (95 °C/5 мин); циклирование — 10 циклов:

  9. Mugal Ответить

    Литература

    Абдулкадыров К. М., Шуваев В.А., Мартынкевич И.С. Современные представления о диагностике и лечении истинной полицитемии. Вестник гематологии, 2015; 11(1): 4-46.
    Абдулкадыров К. М., Шуваев В. А., Мартынкевич И. С. Что нам известно об истинной полицитемии (обзор литературы и собственные данные). Онкогематология, 2015; 3(10): 28-42.
    Arber D.A., Orazi A., Hasserjian R. The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute leukemia. Blood 2016; 127(10): 2391-2405.
    Клинические рекомендации по диагностике и терапии Ph-негативных миелопролиферативных заболеваний (истинная полицитемия, эссенциальная тромбоцитемия, первичный миелофиброз). Национальное гематологическое общество. 2014. http://docplayer.ru/40035289-Rossiyskie-rekomendacii-po-diagnostike-i-terapii-ph-otricatelnyh-mieloproliferativnyh-zabolevaniy-istinnaya-policitemiya-essencialnaya.html
    Ковригина А. М., Байков В.В. Истинная полицитемия: новая концепция диагностики и клинические формы. Клиническая онкогематология. Фундаментальные исследования и клиническая практика. Том: 9, Номер: 2, Год: 2016 Страницы: 115-122. DOI:10.21320/2500-2139-2016-9-2-115-122. https://elibrary.ru/item.asp?id=26323243

  10. VideoAnswer Ответить

Добавить ответ

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *